植物内生菌DNA提取方法_精品文档Word格式文档下载.docx
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1.将2g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5mL磷酸钠缓冲液（19.9gNa2HPO4·
H2O，1.27gNaH2PO4·
2H2O，H2O定容到1L）研磨至匀浆。
2.将植物匀浆转移至50mL无菌离心管中，摇床200rpm振荡1-2h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。
3.取4mL悬液于新的无菌离心管中，12000×
g离心10min收集菌体细胞。
4.弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL1×
TEbuffer（Tris-EDTA；
pH8）中加入10mgmL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。
5.加入50μL20%SDS和8μL20mgmL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。
6.加入200μL5MNaCl，涡旋振荡15s，12000×
g离心10min。
7．取上清液，并向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（24:
1），彻底混匀，12000×
8.上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤7一次。
9.上清液转移至新的无菌离心管中，加入0.6倍体积（0.6vol）的冰冷的异丙醇，4℃放置1h。
10.4℃，12000×
g离心10min，弃上清。
11.沉淀用70%冰乙醇清洗，离心，弃上清。
12.DNA沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解。
13.DNA纯化采用TIANquickMidiPurificationKit。
微生物16SrRNA基因V5-V6-V7区域扩增引物：
799F2：
GATGGCCATTACGGCCNNNNNN
1193R：
ACGCATCCCCACCTTCCTC
用含10%SDS提取缓冲液（NaP缓冲液）重新悬浮细胞团块。
用直径0.11mm的玻璃珠珠打操作50s，以溶解细胞。
用苯酚-Tris（pH8）溶液和氯仿/异戊醇提取，用0.6vol的异丙醇和0.5mol/LNaCl通过沉淀再次获得DNA。
用70%的乙醇洗涤细胞团块，真空干燥，再溶解在50μl的超纯水中。
原始DNA提取物用Glassmilkpurificationkit（Bio101,LaJolla,CA）进一步纯化。
所需试剂：
Na2HPO4·
H2O，NaH2PO4·
2H2O，10%SDS（十二烷基硫酸钠），Tris饱和酚，氯仿/异戊醇（体积比24:
1混合），异丙醇，0.5mol/LNaCl，70%乙醇。
苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用
抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？
酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:
1）使用。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。
加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。
一般采用氯仿与异戊酵为24：
1之比。
也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：
24:
1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：
1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定
Tris平衡苯酚的配制方法
1.使用原料：
大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。
但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。
同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。
因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。
2.操作注意：
苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。
所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。
3.苯酚平衡：
因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下：
①液化苯酚应贮存于-20℃，此时的苯酚呈现结晶状态。
从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68℃水浴中使苯酚充分溶解。
②加入羟基喹啉（8-Quinolinol）至终浓度0.1％。
该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂，同时因其呈黄色。
有助于方便识别有机相。
③加入等体积的1M
Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。
④重复操作步骤③。
⑤加入等体积的0.1M
⑥重复操作步骤⑤，稍微残留部分上层水相。
⑦使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。
⑧将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存
唐琳的引物：
F357GC（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）
R518（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）
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