lmol/LHCl调pH到6.8
20.01mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)
用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制
其中磷酸盐缓冲液配法:
0.2mol/LNa2HPO449ml
0.2mol/LNaH2PO45lml
3.1%TrltonX—100,用M—缓冲液配制。
4.0.2%考马斯亮蓝R250。
配制用的溶剂为:
甲醇:
冰醋酸:
水
(46.5:
7:
46.5)。
·
5.3%戊二醛溶液,用9.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制
6.50%,70%,95%乙醇。
7.叔丁醇
8.正丁醇
9.二甲苯。
10.中性树胶。
六、实验步骤
1.撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小,取若干片,置于装有pH
6.8磷酸盐缓冲液的50ml烧杯中,用镊子轻按入使其浸没5min。
2.吸去磷酸盐缓冲液,用l%TritonX—100处理20—30min。
3.吸去TrironX—i00液,用M-缓冲液洗3次,每次10min左右。
4.用3%戊二醛固定0.5h。
5.再用磷酸盐缓冲液洗3次,每次10min。
6.0.2%考马斯亮蓝R250染色20—30min(在染色板上)。
7.用蒸馏水洗1—2次,将样品置于载玻片上,在普通光学显微镜
下观察,先低倍,再高倍,最后用油镜。
8.如观察结果较佳,可制作永久封片:
在有样品的50ml烧杯中,
依次用如下试剂处理:
50%乙醇,70%乙醇,95%乙醇,(1/2)V95%乙醇
+(1/2)V叔丁醇,叔丁醇(以上每个步骤反应5—10min)或正丁醇,正丁
醇,二甲苯,二甲苯(每个步骤5—10min)。
然后,将样品置于载玻片上
展开,镜检后滴一滴中性树脂,盖上盖玻片。
叶绿体的分离与荧光观察
一、实验目的
掌握手工制作密度梯度技术,了解蔗糖密度梯度离心的原理及优
缺点。
二、实验原理
用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度,在离心条件下,叶绿体和比它
沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处,而沉降系数较大的细胞组
分沉到离心管底部,这样,可粗略地分离叶绿体。
三、实验材料
新鲜菠菜叶
四、实验器材
组织捣碎器,高速冷冻离心机,普通离心机,离心管,Corex离心
管,烧杯,漏斗,纱布,载玻片,盖玻片,普通光学显微镜,剪刀,滴管,荧光显微镜。
五、实验药品
匀浆介质(0.25mol/L蔗糖、0.05mol/LTris—HCi缓冲液,
pH7.4):
称取85.55g蔗糖,6.05gTris,溶解在近800ml蒸馏水中,加
入约42.5ml0.lmol/LHCI,最后蒸馏水定容至1000ml。
50%蔗糖溶液,15%蔗糖溶液。
0.35M氯化钠,0.01%吖啶橙
六、实验步骤
(一)叶绿体的密度离心
l.洗净菠菜叶,尽可能使它干燥,去除叶柄、主脉后,称取5g,剪
碎。
2.加入预冷到近0'C的匀浆介质10ml,在研钵内低温捣碎o。
3.捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。
4.滤液移入普通玻璃离心管,在普通离心机上1000r/min离心
1min。
5.在2ml离心管内依次加入50%蔗糖溶液和15%蔗糖溶液,
注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿离心管壁缓缓注入,不能搅动50%蔗
糖液面,50%蔗糖溶液加0.9ml,15%蔗糖溶液加0.5ml。
加液完后,
可见两种溶液界面处折光稍有不同,这样密度梯度就制好了。
6.在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。
7.离心8000r/min,20min。
8.取出离心管,可见叶绿体在密度梯度液中间形成带;用滴管轻
轻吸出滴于载玻片上,盖上盖玻片,显微镜下观察。
还可在暗室内用荧
光显微镜观察。
(二)菠菜叶手切片观察
用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上,滴加1~2
滴0.35mol/LNaCl溶液,加盖片后轻压,置显微镜下观察,
(1)在普通光镜下观察·
(2)在荧光显微镜下观察
(3)用同样方法制片,但滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液染色
lmin,洗去余液,加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
七、实验结果
(一)叶绿体的分离和观察
1.普通光镜下,可看到叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看
到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒,即基粒。
2.以Olympus荧光显微镜为例,在选用B《blue》激发滤片、B
双向色镜和0-530阻断滤片的条件下,叶绿体发出火红色荧
光。
3.加入吖啶橙染色后,叶绿体可发出桔红色荧光,而其中混
有的细胞核则发绿色荧光。
(二)菠菜叶手切片观察
1.在普通光镜下可以看到三种细胞,
(1)表皮细胞:
为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。
(2)保卫细胞:
为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
(3)叶肉细胞:
为排成栅状的长形和椭园形细胞。
叶绿体呈绿色橄榄形,在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。
2.在荧光显微镜下,叶绿体发出火红色荧光,但其荧光强度
要比游离叶绿体弱。
气孔发绿色荧光,两保卫细胞内的火红色叶绿
体侧环绕气孔排列成一圈。
表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞
少。
3.用吖啶橙染色后,叶绿体则发出桔红色荧光,细胞核可发
绿色荧光,气孔仍为绿色。
细胞组分的分离
一、实验目的
掌握分级分离方法。
二、实验原理
利用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异,可采取分级
差速离心的方法,将各组分逐级分离出来。
三、实验材料
小鼠(30克)取肝脏
四、实验器材
同实验七外加eppendorf管、微量进样器、tip头、台式高速
冷冻离心机。
五、实验药品
匀浆介质(0.25mol/L蔗糖+O.Olmol/LTris-盐酸缓冲液
pH7.4),乙醇:
冰乙酸(3:
1),生理盐水,姬姆萨染液,中性红一
詹纳斯绿染液(称取0.04g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于l00ml,
0.25mol/L蔗糖溶液中)。
其中0.01mo/LTris-盐酸缓冲液配法:
0.lmol/L三羟甲基氨
基甲烷(Tris)10ml,0.1mol/L盐酸8.4ml加蒸馏水至100ml。
六、实验步骤
1.低速离心分离细胞核
(1)将饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死,立即剪开腹部,迅
速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污,用滤纸吸干。
,
(2)称取0.5g肝组织,放在小烧杯中剪碎,用少量预冷的匀浆介质
洗涤数次。
(3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。
用4层
纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至Corex离心管中,同时制
备l张滤液涂片,做好标记,自然干燥。
(4漓心机上500r/min离心5min(4℃),将上层溶液吸入2支
eppendof管中,盖紧盖子放在有冰块的器皿内,待分离线粒体时用。
沉淀物作进一步处理。
(5)用5ml匀浆介质悬浮离心下的沉淀物,用吸管混匀,以
1000r/min离心10min(4℃),吸去上清液,用吸管吸出少量沉淀
物上层涂片。
剩余的沉淀物加入0.3-0.5ml匀浆介质,
用吸管吹打成悬液,再制备一张涂片做好标记,自然干燥。
2.高速离心分离线粒体
(1)将步骤l(4)中的eppendof管在台式高速冷冻离心机上以
10000r/min离心5min,缓缓吸出上清液至另2eppendorf管,留
取沉淀物冰浴保存,待涂片鉴定。
(2)另2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000r/min离心
5min。
(3)吸去上清液,沉淀物置冰浴中,待制片鉴定时用。
3.分离物的鉴定
(1)细胞核。
将步骤l中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定
15min,吹干,滴姬姆萨染液(原液用1/15mol磷酸缓冲液
稀释10—20倍)染色10min,自来水冲洗,吹干,在高倍镜
下比较观察涂片。
(2)线粒体。
在2张干净载玻片中央各滴2—3滴中性红—詹纳斯
绿染液,取步骤2高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片
上,染色30min后分别盖上盖玻片,在高倍镜下观察。
附:
更精致的分