腺病毒的一些常见问题及解答Word格式.docx

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正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。

基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。

以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。

2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：

用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？

如果用脂质体，哪家的最好？

H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，

二是不用筛选直接用于实验。

但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因

素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细

胞传代，外源基因会逐渐丢失。

　当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞

相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大

培养。

3.重组腺病毒作基因治疗，因为不是很了解，用AdEasy系统可以吗？

具体的

实验步骤是来自什么地方？

主要细胞及试剂的来源？

.BIOgene公司有整个系统，从质粒到细胞都有，我AdEasy的基本原理请参阅文献

Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.95.pp.2509-2514,March1998

4.以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染，查文献，病毒滴度测定用噬斑法，但所用细胞不统一，是否有统一规定？

就用肿瘤细胞来测行吗？

只有能反式提供E1的细胞才能用来测腺病毒滴度，一般用HEK293细胞，用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑。

1）腺病毒E1区有转化细胞能力，出于安全性的考虑，也是为了增加载体的包装容量，现在通行的腺病毒载体是E1区缺失的。

2）由于E1区是复制必需区，所以需要包装细胞系反式提供E1蛋白，这种细胞系最常见的就是293系列和911细胞。

3）病毒感染性滴度的测定方法有几种。

一般是通过噬斑记数来测定的，所以需要能够支持病变的细胞基质。

如果你的病毒带有荧光或颜色标记，可以用一般的细胞系进行滴度测定，前提是病毒可以感染这种细胞。

5.腺病毒主要通过CAR介导感染细胞，感染效率不仅和MOI有关，而且与靶细胞表面的CAR表达量相关，例如对于单核细胞，由于CAR表达量很低，无论MOI有多高，感染率都很低；

但对于其他多种细胞类型，腺病毒介导的基因转染效率都很高。

而对于脂质体介导的转染来说，脂质体和基因载体的用量都有一定的限制，超量使用对细胞的毒性很明显。

我个人认为这两种方法的可比性不强，而且后者在大多数情况下转染效率低于前者。

“腺病毒的转染效率主要取决于靶细胞表面的CAR表达水平和感染时所选定的MOI“的含义是什么？

外壳蛋白未经过改造的腺病毒载体对细胞的有效感染需要细胞膜上表达有两个必要的受体，即负责腺病毒与细胞粘附接触的柯萨奇－腺病毒受体（CAR）和负责将腺病毒内化的整合素型受体（αⅤβ3、αⅤβ5或αⅢβ1）。

上述所说应该是5型Ad（属于A组腺病毒）。

对于B组腺病毒如Ad35，其细胞受体是CD46，在人的所有体细胞表面都有该受体。

所以35型腺病毒可以感染几乎所有的人的体细胞。

AGTC公司新近推出的Ad5F35载体是将Ad5的Fiber改造成Ad35的Fiber。

因此，将会对许多研究者开展干细胞、DC细胞或其它Ad5难以转导的细胞的基因转移研究有很大帮助。

MOI是病毒浓度的单位。

1个MOI定义为加入到细胞中的病毒颗粒数，即理论上一个细胞中转入一个病毒颗粒。

6.腺病毒的保存方法是什么？

温度应是-20、70、80℃？

要不要加保护液，例如甘油什么的？

做体外实验要不要纯化腺病毒？

越低保存时间越久。

可以不要。

根据需要一般如果在10e10以上可以不用。

80℃，10%甘油保存即可。

腺病毒没有那么娇，关键看何时要用，4度冰箱可放置1－3月，－20度可保存1－2年，此外，体外的滴度要求不高，无需纯化，但滴度还是要测的。

而体内一定要纯化至高滴度，一般是在超滤下完成。

每次超滤要损失80％，工作量很大哦。

8.用脂质体转染293需7-10天，在这期间要从板分到瓶，可不可以用胰酶消化？

用脂质体转染293细胞是只需要一天时间，一般是先将生长状态较好的细胞约50－70%传入一新瓶，约12－24小时，用100ulHBS＋10ul脂质体，混合，最好用聚丙已烯管，另外一管用100ulHBS＋10ulDNA混合，然后两者作用10-15分钟，用来转染293，293先用无血清DMEM清洗二次，避免细胞悬浮，加入2ml左右无血清培养基，再缓慢加入上面的混合液，12小时左右，换含10%血清的DMEM，一般几天后，培养基消耗尽后应换液，也可以从板分到瓶，或是从小瓶分入大瓶，但绝对不可以用胰酶消化。

9.转染后收病毒时，只取293细胞弃上清进行冻融还是连培养上清和细胞一起要呢？

我的实验是等细胞出现50%左右CPE后，一般要传至2-3代才能成功，上清液我通过PCR等实验后，发现并没有病毒释放，所以还是直接1000g，5min，离心，加入1ml左右PBS，分入eppendorf，再进行冻融，3－4次后，离心，再转染新的293，

10.转染48小时后分板时，由于没用酶，简直吹不下来，吹下来的也成团的厉害，怎么处理？

直接种在25CM2瓶中，过上7天左右，当中换液，分板的话不能用酶，293细胞应该比较好吹的，如在75CM2中则相对难吹。

收病毒的时候都是细胞有CPE，好多上浮，随便吹就可以。

11.腺病毒质粒（含GFP）转染293后有少量荧光出现,再感染扩增后看得到293有病毒感染的变化,但是没观察到荧光,是本身转染失败了,还是仅GFP丢失呢?

会不会有病毒产生却没GFP呢?

可能是应用了AdEasy腺病毒系统，即是第一代非增殖腺病毒系统之一。

这一类腺病毒通常是E1缺失伴有E3缺失，它在293中增殖需要293中E1区的功能，同时它可能与293中E1区发生同源重组，从而产生野生型腺病毒。

由于野生型腺病毒在293的增殖能力通常大于AdEasy腺病毒系统，因此随着病毒传代次数增加，其野生型腺病毒越来越多，需要带有目的基因的AdEasy腺病毒越来越少，就可能出现上述情况。

检查是否出现野生型腺病毒，可用E1内设一对引物，如阳性，即出现野生型腺病毒。

亦可以将病毒接MOI=1感染Hela细胞，如出现病变，即出现野生型腺病毒。

E1缺失的腺病毒在不表达E1的Hela细胞上是不扩增的，而野生型腺病毒可以扩增，从而产生病毒病变斑。

我想选moi=1的目的是避免E1缺失的腺病毒滴度过高，产生细胞病变，影响观察。

当然不一定为1，低一点好些。

12..已构建目的基因的腺病毒AdEasy-1用PacI酶切后，转染293细胞，293细胞的融合度是多少时合适？

70-80%

13.为什么转染后需要孵育7-10天才能行？

病毒增殖需要时间

14.如果不到7天293细胞就出现了CPE，怎么办？

可以挑克隆坚定

15.如何测定病毒滴度？

哪种方法更好些？

TCID50法或空斑法

16.如何计算需要扩增病毒的量？

产量大概是1E4PFU/CELL

17.一个重组腺病毒载体，用293细胞扩增，但加入病毒好几天后，细胞还在长，也没有观察到CPE的出现，最有可能是什么原因？

细胞应为HEK293，请确认不是293T；

是重组病毒还是重组病毒载体？

前者可以直接扩增，后者因系统不同需要共转染或转染HEK293获得重组病毒；

在细胞密度较大的情况下，CPE出现要晚一些；

病毒滴度，这要问提供者；

18.何为AdEasy？

是一种利用细菌进行重组的腺病毒系统，相对于早期在293细胞中重组的腺病毒系统而言，它具有操作简单，重组成功率较高、重组时间较短而被人们广泛应用。

但随着对该系统的广泛应用，该系统存在着明显缺陷，首先应用该系统获得重组腺病毒通常病毒滴度较低，我们曾经应用该系统重组了十多个腺病毒，随一个腺病毒滴度较高外，其它腺病毒滴度在2-10x10E8/75cm2瓶子，明显低于其它腺病毒系统重组系统。

其次该系统采用humanCMVpomoter，使其目的基因的表达量（特别是动物体内）明显低于Micobix公司及新基因网站中的采用mouseCMVpomoter。

再次，该系统相对Micobix公司、新基因网站的Cre-Loxp及Clontech的Adeno-X的腺病重组系统而言，操作过于复杂，重组成功率低、重组时间较长。

当然AdEasy还有一些优势，如它可同时携带EGFP以便于检测。

AdEasy的缺点并不在于其复杂，实际上对于一般的分子生物学实验室而言，经过改进的AdEasy重组方法的技术难度为0。

如楼上所说，AdEasy病毒滴度常常上不去（而腺病毒载体的主要优点之一就是易于制备高滴度病毒），这主要是由于其利用的是细菌内重组，远不如细胞内重组严格，导致腺病毒的基因组序列常会发生一些突变，从而影响病毒的复制功能。

因此，我更倾向于在包装细胞系内利用位点特异性重组（如Cre-Loxp等）方法获得重组腺病毒。

19.目前关于合适载体的选择，是决定基因治疗是否有效的关键因素之一。

一般来说，载体的选择主要从以下方面考虑：

①转移目的基因所要表达时间的长短，②靶细胞的分裂期，③靶细胞的类型，④转移目的基因的大小，⑤载体是否引起机体的免疫反应以及是否具有毒副作用，⑥载体是否可以多次导入体内，⑦构建载体的难易程度，⑧载体转移系统的有效性和可行性，⑨载体的安全性和目的基因的可调节性

基因治疗的载体分为非病毒载体和病毒载体。

非病毒载体主要包括裸质粒、基因枪、阳离子脂质体－DNA复合物，DNA－配体复合物等方法。

但更常用的是病毒载体，常用的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和腺相关病毒，其中逆转录病毒介导的基因转移具有高效、能整合及拷贝数恒定等优点，但只能感染分裂复制的细胞，因而对高度分化而不分裂的细胞就难以实施基因转移，同时在辅助细胞中有可能同源重组成野生型病毒，引起细胞恶性转化。

另外，逆转录病毒介导的基因转移多属于exvivo方式，需将靶细胞从体内取出，进行基因修饰，然后移植到体内，技术要求高，操作复杂。

腺病毒具有高滴度、高感染性等优点，但腺病毒不能将外源基因整合到细胞染色体，它所介导的基因只能在细胞内暂时表达，腺病毒的基因组比较大，在转移外源基因的同时也表达大量病毒蛋白，机体很可能识别这些病毒蛋白质，并将受感染的细胞杀灭，所以，腺病毒不能使外源基因在体内长期有效表达。

腺相关病毒载体具有具有转染效率高、表达稳定、表达持续时间长等优点成为目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一。

但是腺相关病毒载体具有基因表达明显的“滞后性“，对于要求目的基因转移后就产生即刻效果来说，还存在一定的问题。

所以，寻找一种合适的载体用于基因治疗，是非常关