实验方案Word下载.docx

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7-8.

采用体内研究方法,考查其对荷瘤小鼠生存质量的影响,包括观察荷瘤动物一般情况,计算荷瘤小鼠生存率和生命延长率。

1.1试验药物�西黄丸,九寨沟天然药物集团有限公司生产,批号:

080401,实验时用蒸馏水配制为混悬液予动物灌胃;

注射用环磷酰胺（0.2g/瓶）,山西普德药业有限公司,批号20080807,临用前用蒸馏水新鲜配制。

1.2动物昆明种小鼠,SPF级,体重18~22g小鼠,雌雄兼用,由成都中医药大学实验动物中心提供,动物合格证号SCXK（川2004-11）。

1.3细胞株小鼠肝癌细胞株H22、小鼠艾氏腹水瘤细胞株EAC,均由成都中医药大学病理教研室提供。

1.4方法�将液氮冻存小鼠肝癌H22瘤株进行复苏,经体外培养增殖,生长稳定后以5×

106细胞量接种于昆明小鼠腹腔内,待其长出癌性腹水后传代培养至3代,取小鼠无血性的癌性腹水,供接种使用。

实验时将第3代的肿瘤小鼠癌性腹水用无菌生理盐水调整细胞数至5×

106,接种于昆明种小鼠腹腔注射接种（每只注射0.2ml）。

取体重为18~22g的小鼠（每次实验使用同一性别的小鼠）,常规消毒后每只小鼠腹腔注射H22瘤液或EAC荷瘤小鼠接种,接种后次日,将动物称重并分层随机分为4组,分别为模型对照组、西黄丸高、低剂量组及环磷酰胺

组。

西黄丸各组给予西黄丸混悬液灌胃,低剂量组给药剂量为1.08g/kg（西黄丸每日人用量6g,以50kg为正常人体重计算,给药量相当于人用量9倍）,高剂量组给药剂量为2.16g/kg（相当于人用量18倍）,环磷酰胺组予0.02g/kg环磷酰胺灌胃给药,模型对照组予等体积生理盐水灌胃。

每日灌胃给药1次,连续

10天后停药。

观察动物的一般情况,包括毛色、活动度、进食量、体重等,并记录动物在接种肿瘤后的死亡时间。

以对照组20%动物存活时间不得超过4周为依据,故设第29天终止实验,并计算小鼠生命延长率。

抑瘤作用是西黄丸的主要药理作用，实验显示1.08、2.16g/kg剂量下西黄丸对H22荷瘤小鼠及EAC荷瘤小鼠的生存状态明显好于环磷酰胺组（0.02g/kg），同时，西黄丸在2.16g/kg剂量下，可明显延长荷瘤小鼠的生存时间，生命延长率可达30%以上。

[4]徐浩,崔立然,刘吉成.西黄丸对H_（22）荷瘤小鼠Bcl-2基因mRNA表达的影响[J].现代预防医学,2011,11:

2120-2121.

本实验采用RT-PCR法测定H22荷瘤小鼠瘤组织中bcl-2基因mRNA在给药前后的表达差异，为传统中成药西黄丸临床上治疗肿瘤提供更科学的理论依据。

进一步研究发现西黄丸可下调H22荷瘤小鼠瘤组织中凋亡相关基因bcl-2基因mRNA的表达。

1.2动物

选用清洁级昆明种（KM）小鼠，体重（20±

2）g，6～8周龄，雌雄各半，黑龙江中医药大学药物安全评价中心（GLP）提供合格证号：

01-10-2。

1.3瘤株

H22瘤株由齐齐哈尔医学院药物研究所提供。

1.4主要仪器及试剂

离心机（Microfuge18Centrifuge，BECKMANCOULTER，德国）；

超净工作台（苏州净化设备厂）；

可见／紫外分光光度计（765PC型上海光谱仪器有限公司）；

电泳凝胶图象分析系统（Backman公司）；

梯度PCR仪（EPPERFOR2002型德国）；

RT-PCR试剂盒（美国Promega公司）；

PCRMarker美国Promega公司）；

bcl-2、β-actin的引物（英骏生物技术有限公司合成）。

1.5实验方法

1.5.1分组及给药超级洁净工作台上无菌取接种于d8转移癌H22腹水（活细胞计数大于95%），用0.9％氯化钠注射液稀释成2×

106／ml，取清洁级KM小鼠雌雄各半，共40只，每只鼠右侧腋部皮下接种0.2ml瘤细胞悬液。

于接种24h后随机分4组，模型组（0.9%氯化钠注射液（LHN）ig0.2ml／10g／d，ipLHN）；

XHW组（XHWig0.2ml／10g／d，ipLHN）；

CTX组（LHNig0.2ml／10g／d，ipCTX30mg／kg／d）；

联合用药组（XHW＋CTX组）（XHWig0.2ml／10g／d，ipCTX30mg／kg／d），连续给药10d，末次给药后禁食12h，颈椎脱臼处死，以75%乙醇浸泡消毒后剥离瘤组织，置于液氮中保存备用。

1.5.2RT-PCR检测荷瘤小鼠bcl-2mRNA的表达按总RNA提取试剂盒操作步骤，从100mg瘤组织中提取总RNA。

取1μlRNA样品，加入DEPC处理水稀释至50μl，混匀后加入比色杯中。

在260nm和280nm分别3次读取吸光度值，RNA

纯度以OD260／OD280的比值表示。

逆转录反应以总RNA1μg为模板，分别加入10mmol／LdNTP2.0μl、5mmol／LMgSO41.5μl、25×

buffer4.0μl、AMV（逆转录酶）1μl，加DEPCH2O至终体积为20μl并混匀。

优化后的逆转录条件为42℃1h，合成第一条cDNA链。

分别取逆转录所得1、2、3、4号cDNA模板各2.0μl，与bcl-2及β-actin的上下游引物（表1）各0.5μmol／L配制成25μl的PCR反应体系，加入到96孔板中，1、2、3、4四个样本各设置6个复孔，加入循环参数为94℃5min，然后94℃30s，58℃40s，72℃50s，共40个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子量比较鉴定之后，在数字成像仪上照相、扫描分析。

[5]马杰,王一尧,杨伟,关硕,曾常茜,高文斌,梁文波.西黄丸抗肿瘤作用及其免疫清除功能的实验研究[J].中国中药杂志,2014,39（8）:

163-165.

目的:

探讨西黄丸对荷瘤大鼠的抗肿瘤作用及其对荷瘤机体免疫清除功能的影响。

方法:

采用Walker256建立大鼠荷瘤模型，随机分为空白对照组、模型对照组、香菇多糖组、西黄丸低、中、高剂量组，每组10只。

造模后连续治疗给药14d。

腹主动脉取血，取瘤，计算抑瘤率;

采用流式细胞技术（FCM）检测外周血中CD3+，CD4+，CD8+T细胞及黏附分子B7-1（CD80）的含量;

ELISA测定外周血IL-2，IFN-γ表达水平。

结果:

西黄丸高剂量组抑瘤率为33.1%;

与对照组比较，模型组大鼠外周血中IL-2，IFN-γ水平及CD3+，CD4+，B7-1含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;

与模型组比较，西黄丸高剂量组大鼠外周血中IL-2，IFN-γ水平及CD3+，CD4+，B7-1含量增高（P＜0.05）。

结论:

西黄丸可通过提高外周血IL-2，IFN-γ水平及CD3+，CD4+，B7-1含量，增强免疫清除功能，发挥其抗肿瘤作用。

[6]王志宏,王中霞,刘超,欧阳兵,李峰,王文苹,吴超,季旭明.西黄丸滴丸抗肿瘤作用及对免疫功能的影响[J].山东大学学报（医学版）,2013,04:

18-20.

摘要:

目的研究西黄丸滴丸抗肿瘤作用及对免疫功能的影响。

方法将H22荷瘤小鼠模型分为模型组、西黄丸组、西黄丸滴丸不同剂量组，干预10d后，测定各组小鼠的脾指数和胸腺指数，ELISA法测定小鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γ含量。

结果西黄丸滴丸低、中、高剂量均对H22荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用，其抑瘤率分别为62．45%、70．61%、76．93%;

各剂量西黄丸滴丸均能提高免疫器官的质量及血清中TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γ含量。

结论西黄丸滴丸具有明显的抑制肿瘤生长和增强机体免疫功能作用。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物与瘤株昆明种小白鼠，体质量18～22g，雌雄各半，山东中医药大学实验动物中心提供，SPF级实验室喂养;

腹水型小鼠肝癌H22细胞株购自山东省医学科学院药物研究所。

1．1．2实验药物与试剂西黄丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号:

Z11020073;

西黄丸滴丸（自制）;

环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股

份有限公司，批号:

100231-201203。

TNF-α、IL-1、IL-6、INF-γELISA试剂盒购自上海研辉生物科技有限公司。

环磷酰胺是广泛应用的抗癌药物之一，治疗恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、尤文瘤、软组织肉瘤.

1．2方法

1．2．1西黄丸滴丸的制备工艺条件为PEG8000∶PEG10000=1∶1作为基质，药物与基质比为1∶1．5，二甲基硅油100作为冷却剂，冷却剂温度采用梯度冷却方式（上部温度30℃，下部温度0～5℃），药液温度75℃，滴速20～25滴/min，滴距为4cm。

称取一定量的基质，75℃熔融后加入采用超临界CO2提取技术提取的乳香、没药中有效成分挥发油及超微粉碎技术制得的牛黄麝香粉末，混匀后滴制。

1．2．2移植瘤模型的建立无菌环境下，抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，生理盐水稀释，调整细胞浓度为（2～3）×

107/mL，测定细胞活力，活细胞率≥95%。

每只小鼠右腋下接种0．2mL。

1．2．3西黄丸及滴丸对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用接种24h后，将小鼠随机分为6组:

模型组，西黄丸组（2．2g/kg），滴丸低、中、高剂量组（1．5、3．0、6．0g/kg），CTX组（20mg/kg），每组10只。

西黄丸及滴丸各剂量组灌胃给药，模型组给予等容量生理盐水，每日1次;

CTX组腹腔注射，每2天1次。

给药10d。

停药次日脱颈椎处死荷瘤小鼠，剥离瘤块，称瘤质量，计算抑瘤率。

抑瘤率（%）=（对照组平均瘤质量－治疗组平均瘤质量）/对照组平均瘤

质量×

100%。

1．2．4西黄丸及滴丸对小鼠免疫功能的影响按照上述方法制备荷瘤小鼠，分5组给药干预:

模型组，西黄丸组（2．