第24章病毒感染的检查方法与防治原则Word文档格式.docx

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肠道感染采集粪便标本；

脑内感染采取脑脊液；

皮肤感染采取病灶组织，如疱疹液体；

有病毒血症时采取血液；

对某些病毒尿液标本的分离率也比较高。

3．标本运输病毒是细胞内寄生物，脱离活体后在室温下很易丧失感染能力。

标本采集后，应放入装有冰块的冷藏包内尽快运送到实验室，标本在处理、接种前切忌反复冻融，病变组织则应保存于50%的甘油缓冲盐水中。

4．标本的处理与储存采集标本时要注意无菌操作，应尽量避免外界污染。

收到标本后，应尽快处理并保存标本，处理前，含有有包膜的病毒的临床标本中可加入高浓度的青霉素、链霉素、万古霉素等；

对无包膜的病毒的临床标本，可在标本内加入一定量的氯仿。

标本中加入抗生素或氯仿的目的是杀灭标本中可能存在的细菌、支原体、真菌等病原体。

处理后的标本要加入一定量的标本保存液（例如，含2%胎牛血清的MEM、DMEM、PBS等），尽量及时接种，如不能当时接种，标本应保存与-70℃低温冰柜或液氮中。

（二）供血清学检测的标本采集原则

检测特异性抗体需要采取急性期与恢复期双份血清，第一份尽可能在发病后立即采取，第二份在发病后1个月时采集。

血清标本应在-20℃保存，试验前血清标本以56℃30分钟处理去除非特异性物质及补体。

无菌性脑炎患者也可取脑脊液检测特异性lgM。

二、病毒分离

（一）细胞培养（cellculture）

是目前最常用的分离病毒的方法。

在初步了解欲分离的检测病毒后，将选择适当的原代培养细胞或传代细胞系等作病毒分离培养。

接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。

当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。

这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。

虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。

如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的几率。

再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。

1．细胞培养类型按细胞的来源、染色体特征及传代次数又可分为原代细胞、二倍体细胞与传代细胞系等3种基本类型。

（1）原代细胞培养（primarycellculture）：

用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1～2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞。

常用的有人胚肾、猴肾、鸡胚等原代细胞。

原代细胞对病毒的敏感性高。

原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊髓灰质炎疫苗。

因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。

（2）二倍体细胞培养（diploidcellcultune）：

原代细胞只能传2～3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。

二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。

二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃）内，作为“种子”，供以后传代用。

目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。

（3）传代细胞培养（continouscellculture）：

由癌细胞或二倍体细胞突变而来，染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。

常用的传代细胞有HeLa（宫颈癌）细胞、KB（口腔癌）细胞、HEp-2（喉癌）细胞、Vero（非洲绿猴肾）细胞等。

由于传代细胞系能有规律地持续传代，容易保存（-70℃～-196℃）且对某些病毒易感，因此，在诊断、科研等非疫苗生产的项目中常被采用。

目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用传代细胞系

（4）淋巴细胞培养（lymphocyteculture）：

正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。

然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。

T淋巴细胞在加入T细胞生长因子（IL-2）后可在体外培养，为研究人类逆转录病毒（HIV、HTLV）提供了条件，HIV在T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。

2．细胞培养中病毒的鉴定。

（1）病毒在细胞内增殖的指征：

1）细胞致病作用（cytopathogeniceffect,CPE）：

病毒在细胞内增殖引起细胞退形性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。

某些病毒产生特征性CPE，普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变（图25-2），结合临床表现可作出预测性诊断。

AB

CD

图24-1病毒致细胞病变效应（CPE）

A.正常单层细胞（FRhK-4cell）B.SARS病毒感染的单层细胞

C.麻疹病毒感染Vero-SLAM所致的融合病变D.呼吸道合胞病毒在细胞内产生的包涵

2）红细胞吸附现象（hemadsorptionphenomenon）：

流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24～48小时，在细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。

若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。

这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。

3）干扰现象（interferencephenomenon）：

一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。

前者为不产生CPE的病毒（如风疹病毒）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进入宿主细胞不再生产CPE。

（2）病毒感染性的定量测定：

1）空斑形成单位（plaque-formingunit,PFU）：

测定这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。

将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。

当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的的背景中显出没有着色的“空斑”，清楚可见。

由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位（PFU）来表示。

2）50%致死量（LD50）或50%组织细胞感染量（TCID50）的测定：

本法可估计所含病毒的感染量。

方法是测定病毒感染鸡胚、易感动物或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于上述鸡胚、易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。

3）病毒形态与结构的观察：

病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属哪一科。

（3）病毒的病原学鉴定：

病毒在细胞中生长、使细胞出现病变后还可用免疫荧光等方法直接检测病毒抗原、分子生物学技术分析病毒核酸组成、序列同源性比较等加以鉴定（见病毒的核酸检测）。

（二）动物接种（animalinoculation）

是最原始的病毒分离方法，目前已很少应用。

常用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和猴等动物，接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性而定，有鼻内、皮内、脑内、腹腔及静脉等。

例如嗜神经病毒（脑炎病毒）接种鼠脑内；

柯萨奇病毒可接种于乳鼠腹腔内。

接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。

但要注意有些动物对人类病毒不敏感，或感染后症状不明显。

此外，也应防止将动物体内的潜在病毒当作真正的病原体。

（三）鸡胚接种（Chickembryoinoculation）

鸡胚是正在发育中的机体，有些人及动物病毒能在鸡胚中增殖，因此鸡胚培养是分离某些病毒的一种有效方法。

如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或羊水、尿囊液出现红细胞凝集现象。

按病毒种类不同，可使用不同胚龄的鸡胚，接种于不同部位（见图24-2）。

常用的接种部位有：

绒毛尿囊膜：

用于培养天花病毒、痘苗病毒及HSV等；

尿囊腔：

用于流感病毒及腮腺炎病毒的培养；

羊膜腔：

用于流感病毒的初次分离培养；

卵黄囊：

用于某些嗜神经病毒的培养。

需要注意的是很多病毒在鸡胚中不生长。

图24-2鸡胚接种示意图

三、病毒抗原的直接检出

除对细胞培养中病毒可进行鉴定外，对一些血清型别不多或在常规细胞培养系统中还不能成功培养的病毒，应用免疫荧光或酶联免疫吸附实验直接检测病毒抗原是快速而简单的方法。

（一）免疫荧光法（immunofluorescentassay）

根据抗原抗体特异性结合的反应特点，将荧光色素与待检病毒的特异性抗体以化学的方法结合起来。

而后将荧光标记了的抗体在特定的条件下浸染标本，使抗体与标本中的抗原（病毒）发生结合反应，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。

免疫荧光（IF）法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点。

此方法主要包括直接免疫荧光法、间接免疫荧光法以及在间接法的基础上发展而成的补体结合法。

（二）酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA）

使用病毒特异性抗体检测标本中的病毒抗原。

ELISA法用于鉴定病毒具有简便、快速、特异的优点。

四、病毒抗体的直接检出

应用病毒特异性抗原检测病毒感染患者血清中的抗体也是诊断病毒感染的重要手段，可有IgG和IgM两种。

IgM抗体出现于病毒感染早期，可用于快速诊断病毒感染。

IgG抗体出现较迟，在血清中存在的时间也较长，因此IgG类抗体用于临床诊断必须具有早期和恢复期双份血清，或有随访的血清，两次标本中抗体的效价需有4倍或以上的升高才有诊断价值。

ELISA或免疫印迹法可检测血清中针对某种病毒抗原亚单位的抗体，例如，该法已用于HIV患者抗体的确认实验。

其他常用的方法还包括：

（一）中和试验（neutralizationassays）

是病毒在活体内或细胞培养中被特异性中和抗体作用而失去感染性的一种试验，可用来检查患者血清中抗体的消长情况，也可用来鉴定未知病毒或研究病毒的抗原结构。

中和抗体特异性高，维持时间长，因此流行病学检查常用此法。

（二）补体结合试验（complementFixationAssays）

常用病毒内部可