保健食品中大豆异黄酮的检验方法docWord文档下载推荐.docx
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4．实验部分
4.1色谱条件的选择
4.1.１流动相的选择：
参照国内外文献资料，选择了乙睛—水作为流动相，比较了在相同的进样量情况下,不同pＨ值（pH＝5．０，４．0，3。
5，3。
0）的流动相对大豆异黄酮分离效果的影响.在pH较高时,大豆黄素、黄豆黄素和染料木素的峰有拖尾现象，在pＨ值３．0时峰型较好，拖尾现象得到改善。
通过上述试验的比较，最终确定色谱流动相为:
乙腈—水（pＨ3.0）；
梯度洗脱：
１2％~１8％乙腈，0～10miｎ；
18％～24%乙腈,10～23mｉn；
24%~30%乙腈,2３~30miｎ；
30%乙腈,３０～5０ｍin，80％乙腈，50~5５min.此条件下，保留时间和峰面积比较，有较好的稳定性和重现性。
一次开机,连续运转5天，以下六个分别为第２１,3８，４9,１07，123,1２4针所进标样的保留时间,见表1。
表格1六次进样保留时间比较
单位:
min
名称次数
1
2
3
４
5
6
平均值
RSD（％）
大豆苷
１3。
3７7
13.350
1３。
３32
３7４
1３．373
13.3０0
13.35
０.23
黄豆苷
１4.２7１
14．2４2
14.237
14。
２75
１4。
2７7
20１
25
０.21
染料木苷
19.9０1
19。
823
１9．801
1９。
８90
19．901
７96
19．８5
0。
26
大豆黄素
３2．０21
31.９51
31。
932
32.072
３２。
082
31.0２2
31．85
１.28
黄豆黄素
３3。
336
33。
30３
3３.292
３３。
３6２
382
275
3３。
3３
０.13
染料木素
43。
７3９
4３．524
４3。
5０7
43．8１5
822
43.49７
4３．６５
3６
４.1.2检测波长的选择：
对以大豆苷、黄豆苷、染料木苷、大豆黄素、黄豆黄素和染料木素进行波长扫描，波长范围:
220nm～450nm，光谱图见附页1。
通过光谱图比较，这六种物质在26０nm有最大吸收，因此选定２60ｎｍ作为检测波长。
4.1。
3 标准工作曲线和线性范围
配制不同浓度的标准使用液在上述色谱条件下进行HＰLC测定.线性方程和相关系数
见表2和附页2。
表格2标准曲线数据列表
样品名称
浓度（μｇ／mL）
峰面积
线性方程
相关系数
0．２095
8。
Y=38.2０86９X+４。
０1024
99999
2。
0９５0
８2。
9
10.４750
４08．0
4１.90０0
1619。
7
8３.800０
3１９2。
125.70０0
481０。
1９90
7．5
Y=34.74200X+２。
3１309
９9999
１．9９00
72。
9.９500
350．9
39.8000
1３91．8
79.6０00
2754.0
1１9。
4000
４１５7．2
0．2075
12。
Y=5５。
50528X+5.7７59４
0．９9999
0750
121.0
１0.3７50
589。
4
41.5000
232３。
83．０0０0
4595．3
12４.50００
6922.３
2015
１2．8
Ｙ=5９．7１83９X+6．1733３
0.9９99９
２.０15０
123。
10。
0７5０
6１9．6
4０。
3０00
2428.5
8０.６000
4７99。
1２0。
90０0
7233.２
１9９5
10．８
Ｙ=４3．3０426X+８．176４5
9９999
１.9９50
110.4
９。
975０
44１.5
39。
90００
173６.3
７9。
8000
３4５5.3
119．7000
５196．９
0.2020
１6.6
Y=78。
9279７Ｘ+６.06９00
0.9999９
0200
１67．０
10.10００
8１２．５
40０0
3212.７
8０。
6352．１
121。
200０
9５86．3
由表2可知，本方法的标准工作曲线线性范围较宽，０～1２0μg／ｍL线性良好。
4.2样品处理
4.2.1提取溶剂的选择
大豆异黄酮难溶或不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂,参照国内外相关资料，选择了80%甲醇提取保健食品中的大豆异黄酮成分,８0％的甲醇提取的样品色谱图见附页３。
保健食品片剂和粉末一般以淀粉和糊精作为填充剂，80％的甲醇能够使淀粉和糊精沉淀，另外能够有效提取大豆异黄酮成分；
软胶囊含油脂，用8０％的甲醇作为萃取剂,一方面大大降低了油脂的溶解度，延长色谱柱的使用寿命,也可以有效提取大豆异黄酮。
保健饮料中的大豆异黄酮可溶于水，可以直接用80％甲醇提取。
4.2.2超声时间的选择
保健食品中组分复杂，含有淀粉、糊精、油脂、蛋白等各种成分,能够包容大豆异黄酮有效成分，通过超声萃取能够快速有效的提取.本实验选择0miｎ，１0ｍｉn，2０min,30ｍin，40ｍiｎ进行超声处理。
结果见图1.
图1 超声时间对提取效果的影响
从上图可以看出，超声时间对软胶囊提取影响较明显，超声波能够使软胶囊中油状物破乳，大豆异黄酮成分能够更加快速被甲醇萃取出来,但是随着超声时间的延长,提取量没有明显增加,选定超声时间为２0ｍin。
硬胶囊（粉剂）,粉剂为粉末状物质，它能够较好的分散于８０％的甲醇中，使得其中的大豆异黄酮组分比较容易被提取，所以超声２０ｍin已能够完全提取.
4.3本方法的检出限
本方法的检出限：
进样量为10μL时，大豆苷（daidzｉn）、黄豆苷（glｙcitｉn） 和染料木苷（genisｔｉn）、大豆黄素（daiｄｅin）、黄豆黄素（glycitein）和染料木素（genistｅin）的最低检出浓度均为：
0２μg/mＬ,最低检出量如下:
以大豆异黄酮为主要功能性成分的片剂、胶囊及大豆异黄酮粉末0．００5mg/g,口服液的最低检出量为:
0．0002mｇ/mL,保健饮料最低检出量为：
0002mg/ｍL。
4.4本方法的重复性和精密度
按照本方法，选择五种代表性的大豆异黄酮保健食品进行日内重复性测定，结果表明本方法精密度好，准确度高,操作简便，适合推广应用。
部分结果见下表。
表中,以大豆异黄酮总量计mg／g，饮料的单位为μｇ/mＬ.
表格3日内重复性
单位：
mg/ｇ
次数
名称
１
３
６
RSD（%）
胶囊
5６．28
60。
３5
5８．90
59．２２
5８。
6８
59．７８
８7
2.４
粉末
104.71
10５。
37
1０5.７9
１07.7２
1０3．43
10６。
64
１05.61
1．４
片剂
3５。
1７
34．７6
33．９5
33．74
3３.04
３4。
27
3４。
16
2.2
饮料
107。
５8
１０7．31
１0７。
９0
106．3８
10４。
9２
105。
９１
1０6．67
1。
表格４ 样品中六种大豆异黄酮成分的重复性
单位:
mg/g
次数名称
２
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