总要求发光细菌的获得.docx

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总要求发光细菌的获得

绿色荧光蛋白实验设计报告

尤玉玲2013141241081

张帆2013141494071

实验材料：

PET28a质粒pEGFP-N3质粒

实验目的：

发光细菌的获得

实验整体思路：

•大肠杆菌感受态细胞的制备

•将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转入大肠杆菌

•含PET28a质粒及pEGFP-N3质粒细菌的扩大培养

•PET28a质粒及pEGFP-N3质粒的提取及检测

•质粒及目的基因片段的酶切及检测

•扩增EGPF基因及pET-28a酶切质粒

•酶切质粒及目的片段的连接

•重组质粒转入DH-5α扩增及菌落PCR检测

•重组质粒转化BL21细胞并检测细菌发光情况

一、DH-5α和BL-21感受态细胞的制备

•将0~4℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。

•将分别接种过夜菌：

LB按1:

50的比例接种于2mL的LB液体培养基中，37℃活化培养2～3h至OD=0.3～0.5。

•取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。

弃上清液，沉淀加入0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。

冰上放置15-30min后，4℃下5000r/min离心10min。

•弃上清液，沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20℃冰箱内保存。

二、将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转入DH-5α

•1）取制备好的感受态细胞200μl，冰上解冻，均匀悬浮。

•2）加入2μl目的质粒，轻轻混匀，冰上静置10-30min。

•3）42℃水浴2min后，冰上放置2min。

•4）加入400μlLB液体培养基，37℃，50-100rpm振荡培养1h。

•5）取200μl悬浮细胞涂布在含kana的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。

三、含PET28a质粒及pEGFP-N3质粒细菌的扩大培养

1、将带有质粒pET-28a的大肠杆菌接种在LB液体培养基6ml+12μl（20mg/ml）kana中（加卡那霉素40μg/mL），37C培养12-18h。

2、LB液体培养基：

胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L，琼脂糖15g/L，PH7.5

四、PET28a质粒及pEGFP-N3质粒的提取及检测

碱裂解法提取质粒

溶液Ⅰ：

50mmol/L葡萄糖，

10mmol/乙二胺四乙酸EDTA-Na（PH8.0），

25mmol/L三羟基氨基甲烷Tris-HCl（pH8.0）

作用：

分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解

溶液Ⅱ：

0.4mol/LNaOH，

2%SDS

临用前1：

1等体积配制。

作用：

细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性

溶液Ⅲ：

5mol/L醋酸钾60ml

冰醋酸11.5ml

双蒸水28.5ml

作用：

酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。

大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀

TE缓冲液：

10mmol/L三羟基氨基甲烷Tris-HCl（pH8.0）

1mmol/乙二胺四乙酸EDTA-Na（PH8.0）

提取实验步骤

⏹取培养菌液1.5mL置Ep小管中，10000rpm×2min，弃上清液。

⏹加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min。

⏹加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min。

⏹加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min。

⏹10000rpm×5min，取上清液于另一干净的离心管中。

⏹向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1，v/v），振荡混匀，10000rpm×10min，将上清液转移至新的离心管中。

（酚和氯仿的混合液去除蛋白）

⏹加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:

1），混匀，离心2min,取上清液于新离心管中

⏹向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20C（室温）放置30min。

⏹12000rpm×5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

⏹加0.8mL70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min。

⏹加30μLTE缓冲液，-20C保存备用。

（TE缓冲液：

含有胰RNA酶，可使DNA完全溶解）

DNA琼脂糖凝胶电泳检测

一、实验原理

电泳：

带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。

DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。

因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。

在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：

线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。

当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：

闭环超螺旋〉线状〉开环。

但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。

二、实验步骤

1、琼脂糖凝胶板的制备

称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。

待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μLGoldview混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。

静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。

2、加样

胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μLLoadingBuffer（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。

3、电泳

将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

4、观察和拍照

将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

重组质粒的构建

五、目的基因片段的酶切

原理：

DNA限制性内切酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。

BamHⅠ切割识别序列后产生的粘性末端：

5'⋯G↓GATCC⋯3' →5'⋯GGATCC⋯3'

3'⋯CCTAG↑G⋯5' →3'⋯CCTAGG⋯5'

NotI切割识别序列后产生的粘性末端：

5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GCGGCCGC⋯3'

3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGGCG⋯5'

实验用品

1材料：

提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套

2试剂：

NotI,BamHI,ddH2O（双蒸水保证杂质基本去除，防止DNA降解），10×buffer（目的是给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件），琼脂糖，Goldview（可代替溴化乙锭的新型核酸染料，GoldView™与核酸结合后能产生很强的荧光信号，在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光）

3设备：

移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱

实验步骤

1、分别取两支0.2mlEP管做上记号：

如①②

2、两个EP管中分别配置下列的30μL体系：

①EP管

②EP管

BSA

3μL

BSA

3μL

10×buffer

3μL

10×buffer

3μL

NotⅠ

2μL

NotⅠ

2μL

BamHⅠ

2μL

BamHⅠ

2μL

pET-28a

20μL

pEGFP-N3

20μL

3、将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱370C酶切3h。

4、取5μL①②EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。

5、按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段

六、目的基因片段和载体的扩增

（一）PCR-聚合酶链式反应：

1、将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分

PCR反应体系各成分的量

•template0.1ul

•P1（20mM）0.2ul

•P2（20mM）0.2ul

•dNTPs（10mM）0.4ul

•Taqs（5U/l）0.2ul

•10×PCRbuffer2ul

•ddH2O16.9ul

•Total20ul

2、将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。

预变性95℃3min，变性95℃30s，退火60-55℃30s，延伸72℃1min10个循环，每个循环降0.5℃。

变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min20个循环，72℃延伸2min。

3、PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上。

4、取8ul扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。

（二）琼脂糖凝胶电泳检测

1、称取0.8g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100mL1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60℃左右。

2、轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

3、将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。

4、取5μL①②EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照分别加入样孔中。

5、接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100V,I=30mA。

6、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

7、在凝胶成像分析系统中观察结果。

8、按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段

七、DNA的连接重组

（一）实验原理：

•连接的DNA分子具备的条件：

具有相同粘性末端（同种酶切的片段）的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。

•连接反应温度：

理论上讲，连接反应的最佳温度是370C，此时连接酶的活性最高。

但370C粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即12~160C，连接过夜。

但现在公司提供的连接酶只需要220C连接20分钟即可。

（二）实验用品

1材料：

酶切后的质粒pET-28a，酶切后的目的基因片段，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套

2试剂：

T4DNA连接酶,ddH2O，T4DNA连接酶buffer

3设备：

移液器，台式高速离心机，PCR仪

（三）实验步骤

1、在0.2mlEP管中配置下列的体系：

0.2mlEP管

10×buffer

2μL

T4DNA连接酶

0.5μL

酶切后的GFP片段

9.5μL

酶切后的pET-28a质粒

8μL

2、液体混匀后置于1.5ml离心管中瞬时离心，放入培养箱220C温育20min后，-200C下保存用于转化。

八、重组DNA的转化扩增

1、取出感受态细胞DH-5a让其在冰上自然解冻，每200μL解冻的感受态细胞加入整