分子生物学实验报告Word下载.docx

分子生物学实验报告Word下载.docx

《分子生物学实验报告Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验报告Word下载.docx（17页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

（一）实验原理：

TRIzol法提取组织或细胞总RNA

TRIzol可以在破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

无论是人、动物、植物还是细菌组织，TRIzol法对少量的组织（50-100mg）和细胞（5×

106）以及大量的组织（≥1g）和细胞（>

107）均有较好的分离效果。

（二）实验步骤：

1.样品处理：

1）培养细胞：

收获细胞1-5×

107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。

2）组织：

取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min。

2.加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。

3.4℃离心，12000rpm×

15min，取上清。

4.加入0.5ml异丙醇（或与上清等体积），将管中液体轻轻混匀，静置10min。

5.4℃离心，12000rpm×

10min，弃上清。

6.加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。

4℃，7500rpm×

5min，弃上清。

7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。

注：

（一）操作注意事项

1.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤

（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。

2.实验过程必须严格防止RNsae的污染。

3.要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

（二）RNA实验注意事项

RNA实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；

另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。

RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

实验二RNA定量和电泳分析

一．RNA定量

（一）实验原理：

RNA定量方法与DNA定量相似。

RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。

因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。

如用1cm光径，用ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

RNA（mg/ml）=40×

OD260读数×

稀释倍数（n）/1000

RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。

若比值较低，说明有残余蛋白质存在；

比值太高，则提示RNA有降

（二）实验数据：

RNA浓度=1.4mg/ml;

OD260=1.93;

二.RNA快速电泳

一）快速电泳原理：

电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。

许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。

电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

二）实验步骤：

1）RNA电泳所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用清洗剂洗干净后用双蒸水冲洗二遍后在室温晾干备用。

2）用新的1×

TAE配制1%琼脂糖凝胶,倒胶时溴化乙锭（EB）直接加入凝胶中。

3）制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1×

TAE,缓冲液液面淹过胶面。

3）点样时,样品RNA每10μl加入2μl6×

上样缓冲液，150V电泳10分钟左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的RNA的质量或进行拍照记录。

三）实验数据：

←18S

←28S

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，可为进一步扩增提供模板。

1）取RNase-free的0.5ml微量离心管，冰上依次加入下列试剂的混合物至管中：

5×

BU-Scriptbuffer4μl

dNTPmix（10mM）1μl

Primer1μl

[10pmol/μlOligo（dT）18

或25pmol/μlRandomprimers]

20U/μlRNaseInhibitor1μl

200U/μlBU-ScriptReverseTranscriptase1μl

RNase-freeH2Oto（12-X）μl

充分混匀，短暂离心后置于冰上。

2）加总RNA至以上混合管中：

10ng-1μgtotalRNAor10-500ngmRNAXμl

总体积20μl

（注意：

RNaseInhibitor应于RNA模板之前加入管中。

）

3）充分混匀，短暂离心后执行以下步骤：

1.30℃10分钟；

2.42℃60分钟；

3.99℃5分钟；

4.4℃5分钟

结束后短暂离心收集逆转录产物，-20℃保存备用。

实验注意事项

1.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

2.实验中所有物品都应避免RNA酶的污染。

操作过程中均应戴手套。

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。

典型的PCR由

（1）高温变性模板；

（2）引物与模板退火；

（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：

将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；

人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；

耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。

因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。

它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

（1）生成双链DNA中的特异序列作为探针；

（2）由少量mRNA生成cDNA文库；

（3）从cDNA中克隆某些基因；

（4）生成大量DNA以进行序列测定；

（5）突变的分析；

（6）染色体步移；

（7）RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

（二）操作步骤

1．在冰浴中，将以下各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

2xTaqMasterMix10μl

引物1（10μM）1μl

引物2（10μM）1μl

DNA模板（50ng-1μg/μl）1μl

ddH2O7μl

------------------------------------------------------------

总体积20μl

2．调整好反应程序。

将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。

一般：

在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：

93℃30s→56℃30s→72℃30s，循环30次，最后在72℃保温7min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：

取5μlPCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测。

（三）实验数据：

1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。

最好设立一个专用的PCR实验室。

所有试剂都应没有核酸和核酸酶的污染。

2.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

3.PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

4.为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

5.内参的设定：

主要为了用于靶RNA的定量。

常用的内参有GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。

其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

6.PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。

故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

7.防止DNA的污染：

1）采用DNA酶处理RNA样品。

2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

实验五　PCR产物的克隆

（一）PCR克产物克隆分类及实验原理：

1）PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。

平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。

载体可用EcoRV或SmaI切成平头；

PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。

如果要求不高，PCR产物也可不加处理。

如果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的VentDNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。

平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG8000，也只能很有限地提高效率。

粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。

最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。

如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。

另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。

一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用TaqDNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。

也可以用末端转移酶来完成加T反应。

载体自连、PCR产物串连可以忽略。

如果使用ddTTP，效果会更好。

这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。

2）PC