烟草组培苗实验步骤Word文档下载推荐.docx
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超净工作台、
酒精灯、
解剖刀、
镊子
二、实验方法与步骤
1、MS培养基母液的配制
母液
成分
规定量(mg/L)
浓缩倍数
称取量
(mg)
母液定溶体积(ml)
配1LMS培养基吸取量(ml)
编
号
种
类
倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,置小口瓶中保存,贴上标签注明化合物名称(或编号),浓缩倍数,配制日期和配制者姓名,CaCl2·
2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2、微量元素母液的配制
按要求浓缩100倍的数值称取,分别将各种化合物称量除铁盐(FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA.2H2O)作为一组单独配制外,其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后,定容在1000ml容量瓶中,置小口瓶中保存,贴上标签
3、铁盐配制将FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中,加热,(很重要)不断搅拌,溶解后,两液混合,调PH至5.5加水定容至1000ml,置于小口瓶中,贴上标签。
4、有机物母液配制,按母液要求浓缩50倍,除蔗糖按3%单独临时称量外,其余分别称量后,溶解,定容在500ml容量瓶中,置于小口瓶中保存,贴上标签。
5.母液最好在2~4℃的冰箱中贮存,特别是有机类物质,贮存时间不宜过长,无机盐母液最好在一个月内用完,如发现有霉菌和沉淀产生,就不能再使用。
(1)
制备母液和营养培养基时,所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求,化学药品必须是高纯度的(分析纯)。
(2)
称量药物采用高灵敏度的天平,每种药品专用一药匙。
生长调节剂母液配制:
为了操作方便,节约时间,生长调节剂也可如同配制母液一样,先配成原液,这样配制培养基时只要稍加计算,按需要量取即可。
不同药品在配制时若不溶于水,可用少量不同的溶剂先溶解,萘乙酸(NAA),吲哚乙酸(IAA),赤霉素(GA3),2,4-D等生长素和玉米素(ZT)可先用少量95%酒精溶解,然后加水,如溶解不完全再加热。
激动素(KT)和6-苄基嘌呤(BA)可溶于少量1mol/L的盐酸中,叶酸需用少量稀氨水溶解。
称取50mg生长调节物质,溶解后,在100ml的容量瓶中定容,配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg,配制后一般要求在低温(0~4℃)保存,配制培养基时如每升(1000ml)需添加的生长调节剂物质为0.5mg时,则取1ml母液即可。
三、培养基配制和灭菌
本次实验使用
(1)愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:
MS+2,4-D
0.5
mg/L
+6-BA
1.0
mg/L;
(2)幼芽增殖培养基:
MS+6-BA
+NAA
0.2
(3)生根培养基:
MS+NAA
mg/L。
注意事项:
上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后,加入相应激素所得,
MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述
上述培养基均附加3%蔗糖,0.8%琼脂,pH5.8,培养温度25±
2℃,光照强2000lx。
母液吸取量的计算
配制培养基的升数
公式1:
母液吸取量=
母液体积(CC)×
(配制培养基的升数/母液浓缩倍数)
公式2:
(培养基要求的含量/母液每CC的含量)(各种生长调节剂)
各种母液按顺序编号排列
A.
大量元素;
B.CaCl2.2H2O;
C.微量元素
;
D.铁盐;
E.有机物;
F.生长素萘乙酸(NAA):
配制0.5mg/ml的NAA称取50mg
,
NAA用少量95%
酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml;
G..细胞分裂素、激动素(KT)配制0.5mg/ml的KT
称50mgKT用少量1N
HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
配制培养基(1000ml)
1.
琼脂:
称取5~7g琼脂,加入300ml蒸馏水,加热溶解直至完全溶解为止.
2.
蔗糖3%用质量较好的白糖代替,称取30g白糖,溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水
中。
3、各种母液的吸取(培养基1L)
用50ml量筒量取大量元素母液(A)和CaCl2·
2H2O母液(B)各100ml
分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素(C),铁盐(D)母液各10ml
(3)
用10ml移液管或吸管吸取有机物(H)10ml
(4)
移取激素
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中,混合均匀后,加热至80℃左右,用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0,过酸过碱则用1N
NaoH和1N
HCL调整。
分装:
用一个接有胶管的分装器趁热装培养基,1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中,每个三角瓶约30ml左右(一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右)注:
培养基勿碰瓶壁。
包装:
分装好的三角瓶用封口膜包扎好,标明培养基代号即可进行灭菌。
用具清理和洗涤:
各种母液按原位置摆整齐,用过的量筒,移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净,然后按次序放回原处。
四、培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌(高压蒸汽灭菌锅的使用方法)
具体操作步骤:
高压锅放水至平把架;
把包扎好的培养基装入高压锅;
3.
盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.
4.
然后接通电源.
5.
压力计升至0.05MPa时,打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。
6.
排除冷空气后,关闭放气阀,待压力升到0.11MPa位置时,开始计算灭菌时间,具体方法:
当压力锅指针升至0.12MPa时,关闭电源,待指针下降至0.11MPa时接通电源,不断重复此操作过程,维持20分钟。
7.
灭菌时间达到20分钟后,除去电源,打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后,打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。
8.
经过灭菌的营养培养基不宜放置太长,应尽早使用,但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染,可将培养基置于25℃下保存4天,如果培养基需要贮存较长时间,可在4℃低温下保存。
灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格,无论哪种型号,操作的步骤都很相近。
进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气,关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟,保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。
五、植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌
外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。
因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。
1、接种步骤:
第一步:
清理材料→→流水冲洗→→加入吐温(或洗衣粉)清洗
→→自来水冲洗
第二步:
对材料的表面浸润灭菌
:
70%酒精浸10-30秒→→无菌水
第三步:
灭菌剂处理→→
0.1-1%升汞5-8
min(或其他灭菌剂)
第四步:
无菌水进行冲洗
1.灭菌剂一般要临时配制,现配现用.升汞可以短期储存。
2.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3-4次,升汞一般5-8次,每次不少于3min
。
3.灭菌时要轻轻的搅拌,消除气泡,使消毒更彻底。
4.灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。
5.灭菌液要充分浸没材料。
2、无菌操作可按以下步骤进行:
(1)在接种3天前用甲醛熏蒸接种室,并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌;
(2)在接种前20分钟,打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯;
(3)接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿拖鞋等;
(4)上工作台后,用酒精棉球搽拭双手,特别是指甲处。
然后搽拭工作台面;
(5)先用酒精棉球搽拭接种工具,再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干;
(6)接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等;
材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割。
(如叶片切成0.5cm2的小块;
茎切成含有一个节的小段。
微茎尖要剥成只含1-2片叶原基)在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
(7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外线灯灭菌30分钟,若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。
六、烟草叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化
(1)于超净台中彻底冲洗外植体;
70%酒精消毒3min;
无菌水冲洗3遍,每遍3min;
将烟草叶片残留的水分用灭过菌的滤纸吸干;
白瓷板上用消毒的解剖刀分割为1-1.5cm2的小块;
接入相应的MS培养基上,每瓶接种4-5块。
接入
(1)中培养。
(2)约2~3d后,叶片外植体卷曲、增厚、膨胀;
(3)15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织,愈伤组织诱导率为100%
(4)30d后,从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点
(5)60d后,不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽,芽诱导频率(芽数/块愈伤组织)为25~35,而且还可观察到,该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化(或缺绿)。
但此时若将此缺绿幼芽切下,转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基
(2)上。
(6)3~5d后即可恢复正常,缺绿症状消失,并可不断增殖,发育成绿色健壮
的小苗。
七、诱导生根及移栽与数据记录
取约3~4cm长的无根小苗接种于生根培养基(3)中,约7~8d后,几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根,根诱导频率为3~5,部分在培养基表面的根具大量白色根毛。
当试管苗长至5~6cm高时,打开瓶口,在散射光下放置2d后取出,洗去根部残留培养基,种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中,成活率可达95%以上。
烟草叶片愈伤组织诱导情况
编号
每瓶接种数
愈伤组织诱导率
愈伤组织状态
染菌率
烟草叶片愈伤组织再生植株情况
分化率
每个愈伤组织分化芽数
分化情况
烟草叶片诱导生根情况
生根率
生根情况
再生植株分化根数