流式细胞术免疫标记简介完整PPT资料.ppt

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,T细胞标志,进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能,CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-,CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR-（即CD4、CD8双阴性）,CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+（即CD4、CD8双阳性）,CD7+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8-、TCR+,CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8+、TCR+,CD3+、CD4+、CD8-：

T辅助/诱导细胞（Th/Ti），占T细胞总数的60%70%；

CD3+、CD4-、CD8+：

T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc），20%30%；

CD3+CD4+CD8+：

1%3%；

CD3+CD4-CD8-：

1%10%。

前三种表型细胞的TCR主要为TCR，而CD4-CD8-T细胞主要表达TCR，他们都执行细胞免疫功能。

正常外周血中通常存在的T细胞亚群,CD2是绵羊红细胞受体和淋巴细胞功能相关抗原-2（LFA-2），表达于人95%T细胞、50%70胸腺细胞和大颗粒淋巴细胞（LGLNK）的表面。

CD3是T细胞表面抗原，表达于成熟胸腺细胞、静息和激活的的外周血T细胞，是鉴定T细胞的重要标志，其胞浆和膜CD3是早期和普通型T细胞白血病的主要分型标记。

CD5、CD7是T细胞白血病较特异的标记，也是髓系白血病时最常见的伴随标记。

CD45则是白细胞的共同标记抗体CD25和CD28主要分布于活化T淋巴细胞表面，为活化T淋巴细胞标志。

胸腺细胞、静止T细胞、静止B细胞以及NK细胞表面无表达。

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和II类人类白细胞抗原（HLA-DR）的阳性表达对早期T细胞白血病的诊断有重要价值。

8090和95以上的NK细胞表达CD16和CD56。

用CD3-CD16+CD56+可定义NK细胞。

B细胞标记,B细胞B细胞的分化主要分为B祖细胞、前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞6个阶段。

（1）B祖细胞（pro-B）：

此期最早表达的B细胞特异性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、HLA-DR、CD40、CyCD22。

（2）前B细胞（pre-B）：

CD34和TdT消失，出现CyCD79、CD10、CD20、CD9、CDw78、CD74，c+（胞浆IgM重链）。

（3）未成熟（早期）B细胞（immatureBcell）：

CD9、CD10消失，出现SIgM、CD22。

CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表达增加。

其他新的B抗原CD37、CD2、CDw75、CDw76相继出现。

（4）成熟B细胞（matureBcell）：

SIgM和IgD同时表达，并出现CR、FcR和丝裂原受体，上述B细胞抗原继续存在。

（5）活化B细胞（activatedBcell）：

成熟B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞，继之增生和分化。

在此过程伴随表达B细胞激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相关抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、CD38等。

膜结合型Ig逐渐减少，分泌型Ig逐渐增加。

（6）浆细胞（plasmacell）：

激活B细胞进一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表达增加，CD38抗原再出现。

而SIg和上述B抗原消失。

CD79仍可存在于胞质中。

B细胞上的CD抗原分为：

B细胞限制性（特异性）抗原：

CD19、CD20、CD21、CD22、CD77和CD79，它们的表达只限于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。

B细胞相关性抗原：

CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。

B细胞表面的受体SIg，是B细胞特异性识别抗原的受体，也是B细胞重要的特征标志。

CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。

对中国人而言，CD19是特异性和敏感性最高的。

CD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即表达，持续存在直至B细胞终末阶段外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板表面不表达CD19。

髓系细胞标记,包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、CD61、CD63和CD117等。

这些免疫标记种类繁杂，缺乏特异性和敏感性（与淋巴细胞标记抗体相比）。

3.髓系标记从髓系祖细胞终末分化的成熟细胞（粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞）间各阶段细胞特征性标志还不十分清楚。

根据粒细胞和单核细胞上的髓系抗原表达试将其大致分为七种类型:

（1）粒细胞和单核细胞上都有较强表达的抗原有：

CD13、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、CD156、CD157、CD163。

其中CD13在原粒细胞质中表达比膜上早，在AML诊断上十分重要。

（2）以粒细胞为主，但也存在于单核细胞的抗原有：

CD15和CD65。

CD65是特异性髓系抗原，强表达在成熟粒细胞，弱表达在单核细胞上。

（3）基本表达在粒细胞上的抗原有：

CD16b和CD66。

（4）以单核细胞为主，但也表达在粒细胞的抗原有：

CD14和CD33。

CD14主要强表达在单核-巨噬细胞，弱表达在粒细胞上。

CD33抗原分布只限于造血系统内，表达在髓系祖细胞CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相应的白血病细胞上。

（5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：

CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。

CD68是目前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞系统的特异标志。

（6）造血干、祖细胞抗原有：

CD34和CD90。

CD34除表达在早期造血干、祖细胞外，还表达在约40%的AML和60%的ALL上（7）其他髓系相关抗原：

这些抗原主要存在于其他系细胞上，但在某些髓系细胞上也有表达，如：

CD4、CD7、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。

巨核细胞系在巨核细胞系发育过程中依次出现PPO、CD41a（b/a）、CD41b（b）和CD61（a）、CD42（b）。

还可表达CD36（强）。

正常情况下血小板处于静止状态。

目前研制出的抗血小板单抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD61，主要都针对静止的血小板。

当血小板被激活时，血小板中颗粒内容物释放，整合到活化的血小板质膜内，成为一些激活抗原，如CD62（P-选择素）、CD63及CD107a和CD107b。

红细胞系血型糖蛋白A、H。

流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择,有特异性标志：

选择一种即可，如CD3标记总T细胞；

没有明显的特异性标志：

可以采用不同抗体组合，标记某种细胞。

如Treg细胞公认的标志为CD4+CD25+FoxP3+.表面分子标记可以与胞内分子标记相结合；

免疫荧光标记也可以与其它的标记方法相结合：

如与CFSE进行不同细胞亚群增殖分析。

流式细胞术表面分子免疫标记操作举例,淋巴细胞亚群检测操作程序,一、实验原理：

人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：

T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。

T淋巴细胞表达CD3；

B淋巴细胞表达CD19；

NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3。

利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。

进面得到各亚群的比例。

二、主要试剂：

MultiTESTIMKKit（美国BDBiosciences公司；

CAT:

340503），其中包括：

1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC3、FACSLysingSolution三、实验操作：

1、标本采集：

使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。

2、染色和固定细胞：

标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。

A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC20uL；

A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC20Ul。

A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。

置室温，避光孵育15min。

加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。

300g离心5min，弃上清液。

PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。

1%多聚甲醛0.5mL。

3、上机检测；

分析结果；

打印实验报告。

流式细胞术胞内分子免疫标记操作流程,流式细胞术胞内分子免疫标记操作举例,B淋巴细胞胞内ZAP-70分子检测操作程序,主要试剂：

【临床意义】,