两种CpGODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究Word格式文档下载.docx

两种CpGODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究Word格式文档下载.docx

《两种CpGODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《两种CpGODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究Word格式文档下载.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

应用CpGODN2006瘤苗能够增强白血病局灶肿瘤小鼠的抗瘤作用，使生存期明显地延长，无明显的毒副作用。

【关键词】白血病

AntitumorEffectofTwoAdjuvantsofCpGODNonLeukemicTumorinMouseModels

AbstractToinvestigatetheantitumorandsideeffectofCpGODN1826andCpGODN2006asanadjuvantsonleukemictumorinmousemodels,anacutelymphocyticleukemictumorinmousemodelwasestablished,theninoculatedinactivatedL1210cellsaloneorwithdifferentvaccineadjuvantswereinjectedsubcutaneouslyintoeachDBA/2modelmouseatdifferenttimes.Theactivitiesofmice,thetumorformationrateandthegrowthstatusofleukemictumorwereobserved.Thetumorwasexaminedbypathologicsection.TheresultsshowedthatthevaccineofinactivatedL1210cellsandCpGODN1826coulddecreasetheleukemictumorformationrate,slowdownthegrowthofleukemictumormassinmiceandobviouslycausenecrosisoftumorcells,butitcouldnotprolongthelifespansofthetumorburdenmice;

whileCpGODN2006couldnotonlydecreasethetumorformationrate,slowdownthegrowthoftumormassinmiceandresultinobviousnecrosisoftumorcells,butalsocouldeliminatetheexistingtumormassinmice,andprolongthelifespansofthetumorburdenmice.ItisconcludedthatusingCpGODN2006asanadjuvantenhancestheantitumoreffectagainsttheleukemictumor,prolongthelifespanoftumorburdenmicewithoutobvioussideeffect.

Keywordsleukemia;

tumorvaccine;

cytidinephosphatteguanonineoligodeoxynucleotides

白血病的免疫医治，长期以来一直受到人们的重视。

随着生物科学技术的进展，肿瘤疫苗已经从初期的单纯灭活肿瘤细胞疫苗到今天的利用生物工程成立基因修饰肿瘤疫苗等多种形式。

我科曾经应用白血病瘤苗，主动免疫医治白血病患者，取得了良好疗效［1］，但大多患者注射局部红肿硬结，疼痛，很难坚持医治，这提示咱们寻觅作用成效更好、副作用更小的免疫佐剂。

咱们通过白血病局灶肿瘤动物模型观看免疫佐剂CpGODN1826和CpGODN2006的抗白血病局灶肿瘤作用和毒副反映，为临床医治提供实验依据。

材料和方式

动物及肿瘤细胞

DBA/2小鼠，雌雄各半共38只，体重22-28克，购自第四军医大学动物中心，为二级清洁动物。

小鼠白血病细胞株L1210由西安交通大学生命科学院惠赠。

　　两种CpGODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究要紧试剂

GpGODN1826TCCATGACGTCCCTGACGTT全硫逐磷酸骨架，CpGODN2006TCGTCGTTTCGTTTTGTCGTT全硫逐磷酸骨架，为Coley公司产品；

丝裂霉素C购于上海金康制药公司。

小鼠白血病模型的制备

取对数生长期的L1210细胞，用PBS洗3遍，调整浓度至1×

105/ml，于每只小鼠右肋下皮肤别离注射ml（即5×

104个肿瘤细胞），5-7天后可触及皮下结节。

小鼠肿瘤疫苗的制备

收成处于对数期生长的L1210细胞，800rpm离心8分钟，加入丝裂霉素C（终浓度为100μg/ml），于37℃水浴中放置30分钟，用PSB液洗涤3遍后，调整细胞浓度至2×

107/ml，作瘤苗备用；

将CpGODN1826和CpGODN2006用PBS液别离溶解后，调整浓度至500μg/ml，备用。

实验分组

将小鼠随机分为4组（每组小鼠雌雄各半），每组9-10只小鼠：

①CpGODN1826组：

CpGODN1826（ml，50μg）+灭活的肿瘤细胞（ml，2×

106个）；

②CpGODN2006组：

CpGODN2006（ml，50μg）+灭活的肿瘤细胞（ml，2×

③单独医治组：

生理盐水（ml）+灭活的肿瘤细胞（ml）；

④阴性对照组：

生理盐水（ml）。

免疫医治

于接种肿瘤细胞后的第2，5，8，15天别离给4组小鼠在接种部位对侧肋下皮下注射疫苗或生理盐水ml。

观看并记录

每1-2天，观看记录小鼠的局部注射部位有无红肿、硬结、溃烂等；

观看记录小鼠的一样状况、体重转变、食量大小和是不是有惊厥、竖毛、抽搐等现象持续90天。

应用游标卡尺测量小鼠肿块大小［2］。

病理学检测

切取原接种肿瘤部位、注射疫苗部位皮肤和心肝脾肾等重要脏器，HE染色，观看肿瘤细胞及炎性细胞浸润情形［3］。

统计学分析和处置

以统计学软件（Originallab）对资料进行统计学处置，成瘤率采纳四格表确切概率法；

生存时刻采纳成组设计的两样本配对t查验；

p＜为有显著不同。

结果

不同时期免疫医治后小鼠肿瘤生长情形

免疫医治后不同时期小鼠肿瘤生长见表1-3。

CpGODN1826组的5只小鼠尽管没有肿瘤生长，但4只小鼠全身衰竭死亡，有2只小鼠显现肿瘤消退现象，CpGODN2006组成瘤率已明显下降，有3只小鼠肿瘤已不能触及（表一、二、3）。

疫苗医治后各组小鼠一样状况的观看

正常DBA/2小鼠精神好，活泼，被毛滑腻。

小鼠接种肿瘤后，毛发无光泽，杂乱；

随着肿瘤的生长，小鼠精神萎靡，活动明显减少，肿瘤生长2cm×

2cm后，瘤体局部显现破溃、出血，小鼠全身衰竭，恶液质，4组无明显不同（20天内）。

接种肿瘤细胞20天后，在CpGODN1826组与CpGODN2006组中发觉个别小鼠肿瘤消退。

在阴性对照组小鼠中发觉小鼠尾部有多处隆起。

CpGODN1826组和CpGODN2006组注射后局部形成包块，吸收较快，小鼠无惊厥、躁动，1-2天后包块消失，未发觉明显红肿及破溃现象。

免疫医治后各组小鼠的生存时刻比较

CpGODN2006组、CpGODN1826组、单独医治组和阴性对照组各有6只、2只、2只和1只小鼠活存（90天），CpGODN2006组小鼠的活存期与其它组相较，有显著性不同（附图）。

Figure.Comparisonsoflifespansbetweendiversegroupsofmice.病理检查结果

肿瘤病理CpGODN1862组、CpGODN2006组和单独医治组肿瘤生长活跃，镜下可见大量肿瘤细胞生长，并普遍浸润脂肪组织，没有侵袭至肌肉组织。

长期生存的小鼠在肿瘤注射部位未发觉肿瘤细胞，在重要脏器中未发觉肿瘤细胞转移灶。

阴性对照组肿瘤细胞普遍浸润脂肪组织，部份浸润至周围横纹肌组织。

肝、肺转移情形在所有接种肿瘤细胞的小鼠肺脏中，均未见白血病肿瘤细胞，提示肺部转移可能性小。

CpGODN1862组和CpGODN2006组在肝血窦和肝实质内未发觉肿瘤细胞转移灶。

单独医治组部份小鼠肝脏内发觉了肝血窦内瘤细胞浸润。

阴性对照组中4只小鼠有肝脏内瘤转移，少数小鼠肝细胞变性坏死，长期生存小鼠有肝细胞颗粒样变性。

脾脏情形在CpGODN1862组中没有发觉肿瘤的4只小鼠中，有2只小鼠的脾脏组织巨噬细胞增生，肿大，淋巴滤泡结构不清，未见生发中心。

长期生存的小鼠脾脏未见明显病理转变。

其余各组脾脏组织结构大体正常。

尾部情形阴性对照组4只小鼠尾部显现单个和多个结节，镜下可见局部初期急性脓肿，未见肿瘤组织和细胞浸润情形，其余3组尾部肉眼观看与病理切片显示均无异样。

讨论

肿瘤的疫苗研究要紧有两方面，肿瘤抗原和免疫佐剂的研究。

随着对机体逃幸免疫监视机制的深切研究，人们熟悉到佐剂在肿瘤免疫医治中发挥着很重要的作用，它能提高免疫原性，逆转机体的免疫无能状态，改变机体的免疫应答方向［4］。

CpGODN作为强而有效的免疫刺激剂，一直受到研究者的重视。

咱们选取的两种CpG序列均为B型CpG序列。

依照文献报导［5,6］，A型CpGODN要紧依托激活NK细胞发挥抗肿瘤作用，单独应用于局部的实体瘤成效较好，而B型CpGOND能激活多种细胞因子的产生，上调免疫细胞表面的分子表达，推测其作为免疫佐剂成效更佳。

前期的研究说明，CpGODN1826尽管在白血病小鼠模型中有必然的抗白血病免疫作用，但后期未发生肿瘤小鼠的死亡率增加，提示CpGODN1826在免疫医治中有必然的缺点，还需要对它进行改良或寻觅成效更好副作用更少的免疫佐剂。

通过成立小鼠白血病局灶肿瘤模型，应用两种不同的CpGODN佐剂和灭活细胞作为瘤苗观看它们的抗瘤作用，结果显示CpGODN2006组小鼠的成瘤时刻与成瘤率与阴性对照组小鼠无显著性不同，随实在验的进行，同意过免疫医治的小鼠肿块中央显现出血、坏死，并慢慢消退，小鼠一样状况好转，病理切片显示未发生肝脏和肺的转移灶，6只小鼠均长期生存至实验终止（90天），而CpGODN1826组未成瘤的小鼠衰竭明显，并在短时刻内死亡；

其它2组肿瘤细胞生长迅速，有肝脏转移灶，说明CpGODN2006能够作为免疫佐剂，增强机体对肿瘤抗原的反映性，使得L1210白血病小鼠达到治愈［7］。

咱们推测，其抗肿瘤机理可能是由于CpG序列能够活化多种免疫细胞［8］，产生TNFα，IL6，IFNγ和IL12等多种细胞因子，促使机体免疫反映向Th1方向进行。

这些细