实验六 细菌的生化试验学校教学.docx
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实验六细菌的生化试验学校教学
实验六细菌的生化试验
目的要求
1.通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解;
2.掌握常规细菌生化试验操作方法。
操作步骤
一、糖类发酵(分解)试验
原理:
细菌含有分解不同糖(醇、苷)类的酶,因而分解各种糖(醇、苷)类的能力也不一样。
有些细菌分解某些糖(醇、苷)产酸(符号:
+)、产气(符号:
○),培养基由兰变黄(指示剂溴麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果),并有气泡;有些产酸,仅培养基变黄;有些不分解糖类(符号:
-),培养基仍为兰色。
(一)适用于需氧菌的方法
培养基用邓亨氏(Dunham)蛋白胨水溶液(蛋白胨1g,氯化钠0.5g,水100ml,pH7.6按0.5~1%的比例分别加入各种糖),每100ml加入1.2ml的0.2%溴麝香草酚蓝(或用1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml)作指示剂。
分装于试管(每一个试管事先都加有一枚倒立的小发酵管),10磅高压灭菌10分钟。
如在培养基中加入琼脂达0.5~0.7%,则成半固体,可省去倒立的小发酵管。
0.2%溴麝香草酚蓝溶液配法:
溴麝香草酚蓝0.2g
0.1NNaOH5ml
蒸馏水95ml
方法:
从琼脂斜面的纯培养物上,用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中(如为半固体,应穿刺),在37℃培养,一般观察2~3天,观察时用上述符号标记之。
(二)适用于厌氧菌的方法
培养基:
蛋白胨20g
氯化钠5g
琼脂1g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液1ml
糖10g
硫乙醇酸钠1g
蒸馏水1000ml
将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶内,加热使融化,再加入所需的糖,调整pH到7.0,加入指示剂,分装试管,在10磅高压灭菌15分钟后,做成高层。
方法将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部,于37℃培养。
结果观察同需氧菌。
二、V-P试验(二乙酰试验)
原理:
某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇(Acetymethylcarbinol)→2,3-丁烯二醇(2,3-bytaylenecylycol),在有碱存在时氧化成二乙酰,后者和胨中的胍基化合物起作用,产生粉红色的化合物。
其反应式为:
2CH3COCOOH——→CH3COCHOHCH3十2CO2
丙酮酸乙酰甲基甲醇
CH3CHOHCHOHCH3CH3COCOCH3
2,3-丁烯二醇丁二酮(二乙酰)
培养基:
含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g,完全溶解于1000ml水中后,分装试管内,间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。
方法:
1.O’Meara’s法
试剂:
40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中,加入0.3g肌酐即成。
将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后,于35~37℃培养48小时,于每毫升培养物中加入0.1ml,猛烈摇振混合。
2.Baritt’s法
试剂:
6%α-奈酚酒精溶液为甲液,40%氢氧化钾为乙液。
同上法接种培养细菌,于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升,摇振混合。
试验时强阳性者约于5分钟后,可产生粉红色反应(长时间无反应,置室温过夜),次日不变者为阴性。
三、甲基红(M.R.)试验
原理:
某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸,有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等,而不是生成V-P试验中的二乙酰,从而使培养基的pH下降至4.5或以下(V-P试验的培养物pH常在4.5以上),故加入甲基红试剂呈红色。
本试验常与V-P试验一起使用,因为前者呈阳性的细菌,后者通常为阴性。
培养基:
同V-P试验培养基。
甲基红指示剂:
0.1g甲基红溶于300ml95%酒精中,再加入蒸馏水200ml。
方法:
接种细菌于培养液中,37℃培养2~7天后,于培养物中加入几滴试剂,变红色者为阳性反应。
四、淀粉水解试验
原理:
细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类,在培养基上滴加碘液,可在菌落周围出现透明区。
淀粉琼脂培养基:
pH7.6的肉浸汤琼脂90ml
无菌羊血清(只对不易生长的细菌才加)5ml
无菌3%淀粉溶液10ml
将琼脂加热融化,冷却到45℃,加入淀粉溶液及羊血清,混匀后,倾注平板。
方法:
将细菌划线接种于上述平板上,在37℃培养24小时。
生长后取出,在菌落处滴加革兰氏碘液少许,观察。
结果:
培养基呈深蓝色,能水解淀粉的细菌及其菌落周围有透明的环。
五、枸橼酸盐利用试验
原理:
当细菌利用铵盐作为唯一氮源,并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时,可在枸橼酸盐培养基上生长,生成碳酸钠,并同时利用铵盐生成氢,使培养基呈碱性。
方法1:
Simmons氏培养基:
柠檬酸钠lg
K2HPO4lg
硫酸镁0.2g
氯化钠5g
琼脂(洗过)20g
NH4H2PO41g
1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10ml
蒸馏水加至1,000ml
调整pH至6.8,15磅15分钟高压灭菌后制成斜面。
将上述培养基中的琼脂省去,制成液体培养基,同样可以应用。
将被检细菌少量接种到培养基中,37℃培养2~4日,培养基变蓝色者为阳性,不变者为阴性。
方法2:
Christenten氏培养基:
柠檬酸钠5g
KH2PO41g
葡萄糖0.2g
氯化钠5g
酚红0.012g
半胱氨酸0.1g
琼脂15g
酵母浸膏0.5g
蒸馏水加至1000ml
有的配方尚加柠檬酸铁铵0.4g,硫代硫酸钠0.08g。
PH不必调整。
高压灭菌后做成短厚的斜面。
接种时先划线后穿刺,孵育于37℃观察七天。
阳性者培养基变红色,阴性者培养基仍为黄色。
六、吲哚试验
原理:
细菌分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚(靛基质),经与试剂中的对位二甲基氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚。
培养基:
邓亨氏蛋白胨溶液[同
(一)]
试剂:
常用下述两种。
1.欧立希氏(Ebrlich′s)吲哚试剂
对位二甲基氨基苯甲醛(P-dimethylaminobenzaldehyde)1g
纯乙醇95ml
浓盐酸20ml
先以乙醇溶解试剂,后加盐酸,要避光保存。
2.Kovacs试剂
对位二甲基氨基苯甲醛5g
戊醇(聚异戊醇)75g
浓盐酸25ml
方法:
以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白胨溶液中,37℃培养24~48小时后(可延长4~5天)。
于培养液中加入戊醇或二甲苯2~3ml,摇匀,静置片刻后,沿试管壁加入试剂2毫升。
在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。
也可将一指头大的脱脂棉,滴上两滴欧立希氏试剂,再在同处加滴两滴高硫酸钾(K2S2O4)饱和水溶液,置于含培养液的被检试管中,离液面约半寸,置烧杯内水浴煮沸为止,脱脂棉上出现红色为阳性。
此法略繁,但省试剂且准确,因为将试剂加到液体中,吲哚和粪臭素均呈阳性,而用此法,只是吲哚(它能挥发)呈阳性反应。
亦可以滤纸片浸湿1%的二甲基苯丙烯甲醛的10%浓HCl溶液,然后以接种环刮取一环琼脂的纯培养物涂布于该滤纸上。
细菌涂印周围呈蓝色者为阳性,细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。
厌氧菌用蛋白胨水
蛋白胨20g
葡萄糖10g
硫乙醇酸钠1g
Na2HPO4(无水)2g
琼脂1g
蒸馏水1000ml
加热溶解,调整pH至7.4~7.6,过滤,分装小试管,15磅高压15分钟。
七、硫化氢试验
原理:
有些细菌能分解含硫氨基酸,产生硫化氢(H2S),H2S会使培养基中的醋酸铅或氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。
方法1:
醋酸铅琼脂法
培养基:
肉汤琼脂100ml
10%硫代硫酸钠溶液(新配)2.5ml
10%醋酸铅溶液3ml
三种成份分别高压灭菌,前二者混合后待凉至60℃,加入醋酸铅溶液,混合均匀,无菌分装试管达5~6cm高,立即浸入冷水中,使冷凝成琼脂高层。
方法:
用接种针蘸取纯培养物,沿管壁作穿刺,孵育于37℃1~2天后观察,必要时可延长5~7天。
培养基变黑色者为阳性。
或将细菌培养于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面,在试管的棉花塞下方挂一约6.5×0.6cm2的浸蘸饱和醋酸铅溶液(10g醋酸铅溶于50毫升沸蒸馏水中即成)且已干燥的滤纸条,于37℃培养,观察7天,纸条变黑者为阳性结果。
方法2:
三氯化铁明胶培养基法
培养基:
硫胨(Thiopeptone)25g
明胶120g
牛肉膏7.5g
氯化钠5g
蒸馏水加至1000ml
上述成份灭菌后趁热加入5ml灭菌的10%氯化铁溶液。
立即以无菌操作分装试管,达5~6cm高,迅速冷凝成高层。
方法:
穿刺接种,培养于37℃观察7天,培养基变黑色者为阳性。
八、硝酸盐还原试验
原理:
有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐,而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成对重氮基苯磺酸,且对重氮基苯磺酸与α-萘胺作用能生成红色的化合物N-α-萘胺偶氮苯磺酸,其反应式为:
对氨基苯磺酸对重氮基苯磺酸
(一)适用于需氧菌的方法
培养基:
硝酸钾(不含NO2-)0.2g
蛋白胨5g
蒸馏水1000ml
溶解,调节pH至7.4,分装试管。
每管约5毫升,15磅高压灭菌15分钟。
试剂:
甲液对位氨基苯磺酸0.8g
5N醋酸溶液100ml
乙液α—萘胺0.5g
5N醋酸溶液100ml
方法:
接种细菌后37℃培养4天,沿管壁加入甲液二滴与乙液二滴,当时观察。
阳性者立刻呈红色。
(二)厌氧菌硝酸盐培养基法
培养基:
硝酸钾(不含NO2-,化学纯)1g
磷酸氢二钠2g
葡萄糖1g
琼脂1g
蛋白胨20g
蒸馏水1000ml
加热溶解,调整pH至7.2,过滤,分装试管,15磅高压灭菌15分钟。
方法:
接种后作厌氧培养,试验方法和结果观察同上法,但培养1~2日即可。
九、石蕊牛乳试验
原理:
紫乳培养基中的主要成分为干酪素、乳糖及指示剂等。
由于各种细菌对这些成分的作用不同,引起培养基的变化也有不同,观察的主要变化为:
产酸:
主要从乳糖产生酸,指示剂变酸色(石蕊为红色,溴甲酚紫为黄色)。
酸凝或加有产气:
产酸,并有牛乳的凝固(pH4.7以下);如有气体形成,则凝块中有裂隙,在魏氏梭菌则呈“暴烈发酵”。
凝乳酶产生:
很少或无酸产生,牛乳凝固。
胨化:
部分或大部分牛奶变清亮。
产碱:
细菌产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨,使培养基的pH进一步升高,呈深紫色。
培养基:
加石蕊的酒精饱和溶液于新鲜脱脂牛奶中,使达浅紫色,分装于小试管,用流动蒸汽灭菌,每天1次,每次1小时,共3天。
接种细菌后,培养及观察一周。
石蕊酒精溶液的制备:
8g石蕊在30ml40%乙醇中研磨,吸出上清液,再如此用乙醇操作两次。
加40%乙醇到总量为100ml,并煮沸1分钟。
取用上清液,必要时可加几滴1N盐酸使达艳紫色。
现在多应用溴甲酚紫代替石蕊,即于100ml脱脂乳中加入1.2ml的1.6%溴甲酚紫的乙醇溶液。
方法:
将细菌接种于紫乳培养基中,37℃培养1~7天后观察结果,根据细菌的种类不同,可呈现上述一种或几种现象。
十、凝固血清液化试验
原理:
有些细菌产生胞外酶,可使凝固的血清液化,借此鉴别细菌。
吕氏血清培养基:
1%葡萄糖肉汤(pH7.6)100毫升,无菌羊(牛、猪)血清300ml,混合后,分装于无菌试管,每管约5~7ml,在血清凝固器内摆成斜面,间歇灭菌。
第一天,80℃l小时,于37℃过夜;第二天,85℃1小时,于37℃过夜;第三天,90℃1小时,于37℃过夜。
弃去有污染的管。
方法与结果:
将纯培养物在斜面上作划线接种,于37℃培养1周,观察培养基有无液化。
十一、肉渣消化试验
原理:
有些细菌能够产生蛋白酶,消化肉渣。
熟肉基:
即于pH7.4~7.6的牛肉汤中,于分装试管前,加入半指高的肉渣。
液面上加少量凡