真菌学试验报告Word文档下载推荐.docx
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，石英砂，加饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，勿加，en亦
培养基：
3.1.3.!
^铃薯、葡萄糖琼脂培养基
马铃薯汁滋滋，葡萄糖％升琼脂玄乡
（注：
取去皮马铃薯宓克，切成小块，加水必毫升煮沸％分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至必毫升，加葡萄糖％克，琼脂"
克，溶化后分装，3磅灭菌％分钟
察氏琼脂培养基
蔗糖％升昇乡，总/。
乡，"
0.5和头SO戶Q
0.0®
衲卩0“乡，琼脂乡，蒸憎水滋滋，自然曲
3.7.M夕沙氏培养基
蛋白腺乡，葡萄糖或麦芽糖“乡，琼脂70克，水100心
制法：
7将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调砂即有5左右）分中号试管（约“毫升）包扎，高压tt5°
C20分钟。
趁热斜好，凝固备用。
3.1.3.4马丁氏培养基
葡萄糖7%蛋白腺乡，材庐5®
禺SO/*/。
乡，7%孟加拉红3.34琼脂水视％Z,彫值自然。
抗生素用法与用量：
培养基灭菌之后分装前按链霉素切〜，青霉素殳％71用量加入，冷却到45C）土右未凝固时加入抗生素，混匀倒平板。
四,方法：
«
和采样方法：
在校园内找到银杏、喜树、桂花树并用刀采集叶、茎、根、皮、种子。
“.圧样品前处理：
分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。
老树皮用右％酒精进行表面消毒后，用银子取出，于酒精灯上烧灼3秒至表面焦糊，切成AS/大小置于尢"
固体培养基上。
对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：
右％的酒精漂
（浸）洗2七如-无菌水冲洗“・6次一07%升汞不同的消毒时间（见表仝2共设置7个梯度）一无菌水冲洗“"
次一用灭菌滤纸吸干多余水分一无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成O0X%/大小。
将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。
灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡，使消毒彻底。
在快到时间之前分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水,轻搅漂洗。
灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。
灭菌液要充分浸没材料。
宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
4.1.3内生菌的分离方法：
将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养5块组织块）于刃巴恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。
观察菌丝生长情况及污染情况。
am纯化方法:
培养夕"
天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜E培养基上。
纯化头“次以保证所得菌落为纯培养。
z形态鉴定方法：
4.2」培养方法:
42H培养基：
查氏培养基、沙氏培养基和弋彳培养基。
4.2.2将“°
C保存菌种活化刃欠；
421.3将活化菌种分别点种冲、沙氏、察氏平板，每重复
4.2.1.425aC恒温培养箱培养7天；
421.5然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带子粘片法），观察个体形态；
421.6另两个平行继续培养至力天，取出；
421.7重复步骤“，作为最终描述结果；
421.8根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归属。
“,22制片方法：
胶带粘贴法：
选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。
取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，％%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产泡结构等特征。
鉴定标准：
观察的要点：
彳2“菌落宏观形态：
大小：
以菌落的直径（*«
*«
）表不。
颜色：
包括菌落表面和背而的颜色，及色素是否渗入培养基。
菌落表而的纹饰：
如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。
菌落的质地：
毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。
菌落的高度：
扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。
菌落边缘：
全缘、锯齿状、树枝状等。
渗出物：
菌落表而有无液滴及液滴的颜色等。
425个体形态：
菌丝的特征：
表而性状（粗糙或光滑），宽度等
分生泡子梗：
分支情况■■简单或复杂，轮生或单生等；
长短；
基部粗糙或光滑等。
产泡结构的形态特征：
形状，大小，着生状况（位置，单生、互生或成轮生体）
分生泡子的形态：
形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成
头）
分子生物学鉴定：
培养方法：
培养基成分与不加琼脂的吟固体培养基成分相同。
将液体培养基以7羽必每瓶分装至％02三角瓶中，用了层纱布封口。
WC,蒸汽灭菌203
将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中％0、I2g培养G7天。
用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸憎水冲洗菌丝球S次，避免培养基中的糖类和蛋白对*提取的影响。
％^下烘干菌丝，但是不要过于干燥，然后进行*的提取。
“，M2基因组羽的提取
捉取采刖0*7^3*法°
纟7^矽（dncmcdc,I'
/\烷基三乙基浪化镀）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将刃诊与核酸的复合物同蛋口质、多糖类物质分开，然后将0%与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，刃虫能溶解于乙醇。
刃虫法的好处是能很好地去
掉糖类杂质，提取前期可得到高含量的*。
“.M2」用刃并法提取材料刃％的具体步骤如下:
将切3%在分&
水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；
432.2取0乡左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入刃必预热的提取液及矽“邮■铳基乙醇，混合均匀后把混合液转入2弘必离心管中700以//管；
432.3于650水浴保温0.5•心时间不能超过7.%。
保温期间要轻轻振摇几次;
4.M2.4冷却至室温后，加入等体积（7002的饱和酚：
氯仿：
异
戊醇忽5：
%:
〃，充分混匀后静置7久心。
432.5萬Z1200&
甘,1皿,室温几去沉淀，将上清液转入干净离心管中。
432.6根据杂质的去除情况重复步骤“、5数次，直至无杂质;
4.327加入等体积氯仿：
异戊醇（％：
〃抽提一次以去除饱和酚，离心室温丿；
432.S将上清液逐滴加入两倍体积的•力C预冷无水乙醇，以沉
淀出FM。
曲放H*.10-20伦诚,可以过夜;
432.9挑取或离心去上清液〃
S弘Q的方法取出刃*
右％乙醇洗涤两次；
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歹匕保温箱中干燥后溶于适量的店缓冲液中“t?
备用。
么“所用引物
们S5:
矽乂"
乡加族久0%加妬嗨乡
们S4：
%牝牝7"
7升7"
初？
“.“.卩空反应条件:
“"
"
7体系：
Q空反应体系为羽u公体系，包括:
1110
8%
G7S（厶gcC77P.%7P、^7P）：
各200p%
0.2[i%
7矽酶:
7〜2滋,
送测序公司。
勿分模板:
预变性
亦C
变性
复性
57°
C
延伸
72°
延伸补齐72C
10mui
？
条件：
扩增条件
弘〜55个循环
443测序方法:
“序例分析:
五.结果及分析：
结果：
试验分离到两种真菌
57八爪金盘分离到菌种查氏正反照
菌落宏观形态：
菌落的直径
包括菌落表面棕黑色背而灰色，色素渗入培养基。
如皱纹、整个菌落致密。
毡状
凸起或隆起。
锯齿状。
菌落表而无液滴。
5/?
个体形态：
表而粗糙。
分支复杂，轮生。
5/6分子生物学鉴定
通过R豕扩增和序列分析，送公司检测得到的序列为：
伯gmese妙如如eesgemeg%妙初◎e妙切知"
沪只艸ermgsgigig斤丼幻只we丼只只
ax尹e斤前幻阿的只幻engxxeg®
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通过他”序列分析得到的结果为：
勺如必滋加“100况wz彳锻mtAc2c^eufSc乡心宓©
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