无菌操作基本技术文档格式.docx

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3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。

勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打

开之容器正上方操作实验。

容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°

角取用，

尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。

对于来自人类或是病毒

感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassII）。

操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。

5.定期检测下列项目：

5.1.CO2钢瓶之CO2压力

5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。

5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。

6.水槽可添加消毒剂（Zephrin1:

750），定期更换水槽的水。

实验用品

1.种类︰

1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。

1.2.TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附,

培养容器种类有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。

1.3.plasticsterilepipet:

1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

1.4.塑料离心管:

15ml,50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene（PP）为不透

明材质，polystyrene（PS）为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。

1.5.glasspastuerpipet:

9inch，用以抽掉废弃培养液等。

1.6.玻璃血清瓶（PyrexorDuranglassware）：

100ml,250ml,500ml,1000ml

2.清洗︰

2.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。

2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干

净，勿加清洁剂清洗。

3.灭菌︰

3.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121oC,15lb,20分钟，置于oven中烘干。

3.2.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170oC,4小时。

3.3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液（次氯酸，即漂白水）或是蒸汽高压灭菌121oC,15lb,20分钟。

培养基

1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温热。

2.液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，

可以再添加适量glutamine。

3.粉末培养基配制（以1升为例）：

3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为

7.2-7.4。

NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成

pH之误差，或局部过碱。

因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，

然后用CO2气体调整pH，而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH），因为氯离子对细胞生

长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

3.2.材料：

3.2.1.纯水（milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要）

3.2.2.粉末培养基

3.2.3.NaHCO3（SigmaS-4019）

3.2.4.电磁搅拌器

3.2.5.无菌血清瓶

3.2.6.0.1或0.2mm无菌过滤膜

3.2.7.pHmeter

3.2.8.真空帮浦

3.2.9.CO2气体

3.3.步骤：

3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。

3.3.2.称取适量之NaHCO3粉末（数量依培养基种类而异，表一）溶于200ml

milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。

3.3.3.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。

混后

溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。

若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。

培养基以真空帮浦通过过滤膜时，

pH会升高0.1-0.2。

3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养

基种类、日期、瓶号等，贮存于4oC。

（血清亦可加入培养基中一起过滤）

3.3.5.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

4.配制培养基之生长测试

4.1.材料：

4.1.1.MDCKcell（ATCCCCL-34或CCRC60004）

4.1.2.6-wellTCplate（or35mmTCdish）

4.1.3.methanol

4.1.4.glacialaceticacid

4.1.5.10%Giemsasolution（GibcoBRL10092-013）

4.2.步骤：

4.2.1.以待测试培养基培养MDCKcell，接种MDCK细胞于6-wellplate（或35

mmTCdish）中，每个well接种1×

102活细胞，同时作对照组实验。

4.2.2.接种5～7天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群

落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。

4.2.3.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液（甲醇：

冰醋酸﹦3:

1），室温下静

置10min。

4.2.4.去除固定液，水洗二次。

4.2.5.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

4.2.6.去除染液，水洗二次。

4.2.7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不

佳，则丢弃之。

抗生素

1.细胞库之细胞培养基不加抗生素

1.1.培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。

1.2.培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素，待

tokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。

2.寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素（penicillin100units/ml+

streptomycin100ug/ml）。

3.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制

mycoplasma生长。

4.去除细菌污染之抗生素混合配方:

penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin

250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。

5.抗生素使用种类与浓度：

工作浓度.储存温度.杀灭细菌

penicillin100units/ml-20℃G（+）bacteria

streptomycin100ug/ml-20℃G（+）andG（-）bacteria

chlotetracycline50ug/ml-20℃G（+）andG（-）bacteria

gentamicin50ug/ml-20℃G（+）andG（-）bacteria,mycoplasma

amphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmolds

nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds

fungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds

血清

1.血清必须贮存于–20～-70oC，若存放于4oC，请勿超过一个月。

如果一次无法用完一

瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，

必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。

若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加

入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3.瓶装（500ml）血清解冻步骤（逐步解冻法）:

-20oC或–70oC至4oC冰箱溶解一天，至室

温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。

在溶解过程中须规则摇

晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沈淀的发生。

勿直接由–20oC直接

至37oC解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4.heat-inactivation是指56oC,30分钟加热已完全解冻之血清。

加热过程中须规则摇晃均

匀。

此热处理之目的是使血清中之补体成份（complement）去活化。

除非必须，一般不建

议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。

补体参与之反应有：

cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsand

platelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecell

type。

5.勿将血清置于37oC太久，若在37oC放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较

不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。

6.血清之沉淀物

6.1.凝絮物：

发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）变性

及解冻后血清中存在之血纤维蛋白（fibrin）造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本

身之品质。

若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上

清液可以加