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方法采用MTT法检测槲皮素对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用，Hoechst33258荧光染色对细胞凋亡进行形态学检测，流式细胞术检测细胞周期变化，免疫细胞化学检测survivin蛋白表达，分光光度法检测caspase-3的活性变化。

结果槲皮素抑制肝癌SMMC7721细胞增殖的作用明显，且呈浓度和时间依赖性，槲皮素处理48h的IC50为84.24μmol·

L-1。

形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化，流式细胞仪检测表明经槲皮素处理，肝癌SMMC7721细胞周期阻滞于G0/G1期，且SMMC7721细胞survivin蛋白表达下降，caspase-3活性升高。

结论槲皮素能诱导SMMC7721细胞凋亡，其机制可能是使肝癌SMMC7721细胞周期阻滞于G0/G1期，并下调survivin蛋白的表达，直接激活caspase-3而诱导SMMC7721细胞凋亡。

【关键词】槲皮素；

肝癌细胞SMMC7721；

细胞凋亡；

Survivin；

Caspase-3Abstract：

ObjectiveToinvestigatetheapoptosisofSMMC7721hepaticcancercellsinducedbyquercetinanditsrelationshipwiththeexpressionofsurvivinandactivityofcaspase-3.MethodsInhibitoryeffectofquercetinonSMMC7721cellswasdetectedbyMTTassay.MorphologicalchangesofapoptoticcellsforHoechststainingwereobservedbyfluorescencemicroscope.Cellcyclewasanalyzedbyflowcytometry（FCM）.Expressionofsurvivinproteinwasdetectedbyimmunocytochemistrystaining.Activityofcaspase-3wasanalyzedbycolorimetry.ResultsQuercetinhadasignificantinhibitionongrowthandproliferationofSMMC7721cellsinaconcentration-andtime-dependentmanner.TheIC50was84.24μmol·

L-1aftercellsweretreatedwithquercetinfor48h.evidencewasprovidedthatapoptosisoccurredinSMMC7721cellstreatedwithquercetinusingfluorescencemicroscope.ItwassuggestedthatquercetinblockedSMMC7721cellsattheG0/G1phasebyFCManalysis.Expressionofsurvivinproteinwasdecreased,andactivityofcaspase-3wereenhanced.ConclusionQuercetincouldinduceapoptosisofSMMC7721cellsbydown-regcclatingtheexpressionofsurvivinproteinandactiontingcaspase-3.Keywords：

Quercetin；

HepaticcarcinomacelllinesSMMC7721；

Apoptosis;

Caspase-3槲皮素（Quercetin,Que,3,5,7,3’,4’-五羟基黄酮）广泛存在于植物界，大约68%的植物中都含有。

槲皮素药理作用广泛，具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、抗炎、抗过敏、抗心律失常和清除自由基等多种生物活性及药理作用［1～5］。

近年发现槲皮素不仅对多种致癌剂、促癌剂有拮抗作用，而且可以抑制多种恶性肿瘤细胞的生长［6～10］。

Survivin蛋白是新近发现的凋亡抑制因子，在肿瘤的发生发展中具有重要地位。

槲皮素对肿瘤细胞中survivin蛋白表达的影响，至今还不十分清楚。

因此本课题试图研究survivin表达在槲皮素诱导SMMC7721细胞凋亡中的调节作用，为探讨槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721细胞凋亡的机制提供实验依据。

1材料RPMI1640培养液，胎牛血清（Hyclone公司），槲皮素（Sigma公司），Hoechst33258（Sigma公司），免疫组化染色SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人survivin多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），Caspase-3分光光度法检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

2方法2.1细胞培养人肝癌细胞株SMMC7721，细胞单层接种在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，在饱和湿度，温度为37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养。

2.2细胞生长抑制肝癌细胞SMMC7721，5×

104个/ml，接种于96孔培养板，每孔200μl。

培养24h。

更换10%FBS的含药培养基，使槲皮素终浓度为12.5，25，50，100，200μmol·

L-1，每一浓度重复5孔，分别培养24，48，72h，培养终止前4h加入MTT（5mg·

L-1）每孔20μl，37℃孵育。

终止时弃上清后每孔加入150μl二甲基亚砜，振荡混匀10min，使结晶物充分溶解后，在酶标仪（λ=490nm）上测各孔的吸光度（OD）值，重复3次，按下式计算细胞生长抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率（IR）=｛1-实验组平均OD值对照组平均OD值｝×

100%（以空白组OD值调零）2.3细胞形态学变化观察取对数生长期SMMC7721细胞5×

104个，加入放有盖玻片的六孔板内。

培养24h后，更换10%FBS的含药培养基，设空白对照组和加药实验组，使加药组槲皮素终浓度分别达到40，80，160μmol·

L-1，继续培养48h后，用PBS洗两次，然后用固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定15min，用PBS洗两次，37℃Hoechst33258染色液（5mg·

L-1）染色15～30min，用PBS洗两次，用中性树脂封片，荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。

镜下随机找到5个不重复区，计数200个细胞中凋亡细胞数，其中凋亡细胞所占百分比即为细胞凋亡率。

2.4流式细胞仪（FCM）检测细胞周期以40，80，160μmol·

L-1的槲皮素处理SMMC7721细胞48h后，收集细胞制成单细胞悬液，0.01mol·

L-1PBS（pH7.4）洗两次，70%冰乙醇固定过夜，碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测，分析细胞周期，以未处理的细胞为对照组。

2.5免疫细胞化学法检测survivin蛋白表达取对数生长期肿瘤细胞SMMC7721，2×

105个/孔细胞接种于放置有盖玻片的6孔板，待自然贴壁后，设加药实验组和空白对照组，实验组加入槲皮素，使槲皮素终浓度分别达到40，120μmol·

24h后取出长满细胞的盖玻片置于培养皿中。

此细胞爬片用PBS洗2次，5min/次。

然后按照SP免疫组化检测试剂盒说明书操作。

在光镜下确定有代表性的染色阳性5个视野，随机计数200个细胞，阳性表达为棕黄色，其中阳性细胞所占百分比即为survivin蛋白表达的阳性率。

2.6分光光度法检测caspase-3活性取对数生长期肿瘤细胞SMMC7721，2×

105个/孔细胞接种于6孔板，待自然贴壁后，设加药实验组和空白对照组，实验组加入槲皮素，使槲皮素终浓度分别达到40，120μmol·

培养24h后，收集细胞，用PBS洗涤细胞2次（离心2000r/min，5min），弃去PBS上清。

按试剂盒步骤检测caspase-3活性。

用酶标仪（λ=405nm）测定其吸光值。

2.7统计学处理所得数据以±

s表示，数据处理用SPSS11.0统计软件，组间比较采用配对t检验。

3结果3.1槲皮素对SMMC7721细胞的生长抑制作用从表1可以看出，槲皮素对肝癌细胞SMMC7721的生长有明显的抑制作用，且随药物作用时间的延长和药物作用浓度的升高而增强，存在时间依赖性和浓度依赖性。

24，48，72h槲皮素的半数抑制浓度分别为126.22，84.24和55.06μmol·

表1槲皮素对肝癌细胞SMMC7721生长的抑制作用与空白对照组比较，*P0.05,**P0.01；

n=53.2槲皮素金属配合物诱导SMMC7721细胞凋亡的形态学变化在荧光显微镜下观察，可以看到对照组细胞的细胞核呈规则的椭圆形，核内物质均匀分散。

经槲皮素处理48h后SMMC7721的细胞核明显变小，呈现出不规则的形状，染色体凝聚，有些细胞可以看到染色质聚集在核膜周围，还有一些细胞核发生碎裂成为凋亡小体，这些都是细胞凋亡的典型特征。

表明经槲皮素作用的SMMC7721细胞死亡经历了凋亡过程。

根据Hoechst33258染色结果计算的细胞凋亡率如图1所示。

与空白对照组比较，*P0.05，**P0.01图1SMMC7721细胞经槲皮素处理48h后的细胞凋亡率（%）3.3槲皮素对SMMC7721细胞周期的影响SMMC7721细胞48h后与对照组比较（表2），G0/G1期细胞比例明显增加，S期和G2/M期细胞比例减少，并且药物浓度越高，G0/G1期细胞比例越高。

表明槲皮素能阻止SMMC7721细胞由G0/G1期向S期和G2/M期移行，使细胞阻滞于G0/G1期。

表2槲皮素对SMMC7721细胞周期的影响组别浓度C/μmol·

L-1G0/G1（%）S（%）G2/M（%）空白对照048.330.522.2槲皮素4059.420.120.58064.119.616.316069.618.811.63.4槲皮素对survivin蛋白表达的影响40μmol·

L-1槲皮素和120μmol·

L-1作用SMMC7721细胞24h后，survivin表达明显降低（图2）。

与空白对照组相比，survivin表达率分别降低了32.6%和45.4%。

3.5槲皮素对SMMC7721细胞caspase-3酶活性的影响SMMC7721细胞经40μmol·

L-1和120μmol·

L-1槲皮素处理24h后，caspase-3的吸光度值分别提高了1.81和2.46倍（图3）。

因此槲皮素作用SMMC7721后caspase-3的活性明显升高，其差异显著。

与空白对照组比较，*P0.05，**P0.01图2SMMC7721细胞经槲皮素处理后的survivin蛋白的表达率（%）与空白对照组比较，*P0.05，**P0.01图3槲皮素对SMMC7721细胞的caspase-3活性的影响4讨论细胞的凋亡与增殖作为生物体内并存的一对矛盾，在正常情况下，两者应该维持动态平衡。

细胞增殖、分化