细胞生物学实验指导.docx

细胞生物学实验指导.docx

《细胞生物学实验指导.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞生物学实验指导.docx（20页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

细胞生物学实验指导

2016年细胞生物学实验指导

实验一动物细胞的传代培养

一、实验目的

1．熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。

2．了解细胞传代培养的基本方法和主要操作步骤

二、实验原理

细胞培养（cellculture）是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。

细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。

细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。

另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学和生物因素对细胞结构和功能的影响。

细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。

所谓原代培养（primaryculture）是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。

而传代培养（subculture）是指当原代培养的细胞增殖到一定密度后，将其从原培养容器中取出，以1：

2或其他比例转移到另一个或几个容器中所进行的再培养。

传代培养可简称传代。

在体外培养过程中，要使细胞能正常地生长、繁殖，需经常对其进行传代。

传代的累积次数就是细胞的代数。

在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系（cellline）和细胞株（cellstrain）这两个容易混淆的概念。

一般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞系来源于原代培养，而原代培养物中所含的细胞种类较多，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体所组成，而细胞株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中选择出的细胞群体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记并可持续存在。

细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作。

由于细胞在体外的生长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等多种因素的显著影响，故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营养液配制和除菌、pH值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特别要注意无菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。

三、实验材料

人肝癌细胞株HepG2

四、实验器材

CO2恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、电热高压蒸汽消毒锅、细胞培养瓶、培养皿、吸管、除菌滤器、小烧杯、100mL玻璃试剂瓶、橡皮瓶塞、酒精灯、记号笔。

五、实验试剂

1．DMEM培养液：

用天平称取DMEM培养基粉剂（质量依实验所需培养液的总量而定）倒入烧杯中，按说明书要求加入三蒸水、NaHCO3、谷氨酰胺，利用磁力搅拌器使加入的固体物完全溶解，然后加入适量浓度为20000单位/mL的青霉素和链霉素，使培养液中这两种抗菌素的浓度分别达到100单位/L。

再按比例加入胎牛血清，使其在培养液中的含量达到20％，将溶液充分混匀，用5%的NaHCO3和1M的HCl调培养液的pH值至7.0-7.2。

最后采用孔径为0.22μm的针头式滤器过滤除菌。

2．PBS（不含钙镁，pH7.2）：

分别称取NaCl8.00g、KCl0.20g、Na2HPO41.15g、KH2PO40.20g，加三蒸水溶解并定容至1000mL。

3．D-Hanks液；

①D-Hanks原液：

分别称取NaCl80.0g、Na2HPO4.2H200.6g、KCl4.0g、KH2PO40.6g、NaHC033.5g，加三蒸水溶解至l000mL。

配制时要注意按顺序逐一加入溶解，应等前一种药品完全溶解后再加下一种药品，原液配好后应分装于250mL或500mL玻璃瓶中，高压灭菌，置冰箱内贮存。

②D-Hanks工作液：

取D-Hanks原液l00mL，加三蒸水896mL，再加0.5％的酚红溶液4mL混合均匀即成。

4．0.25％胰蛋白酶（pH7.2-7.6）：

称取活性为1：

250的胰蛋白酶0.25g，另准备D-Hanks工作液100mL。

先用少量D-Hanks工作液将胰蛋白酶粉调成糊状，再将剩余的D-Hanks工作液全部加入，充分搅拌使酶充分溶解，必要时可将容器置于36℃恒温水浴箱中，直至酶液清亮，再用NaHCO3调pH至7.2-7.6。

然后用玻璃滤器除菌，分装于灭菌后的EP管中，密封后置冰箱冷冻室（-18℃）中贮存。

六、实验方法

（一）实验过程中无菌操作的要求

1．培养用品的清洗消毒：

实验中所需的玻璃器皿（如培养瓶、离心管、吸管、小瓶等）和器械（如剪刀、镊子等）应彻底清洗干净，干燥后用牛皮纸包好置高压蒸汽消毒锅中消毒灭菌（蒸汽压力为103kPa，20min）。

而培养液、PBS液、胰蛋白酶液、PBS液等应利用抽滤法除菌。

将已消好毒的实验所需物品收集并清点好置于超净工作台内，避免实验开始后再从工作台外取物而受污染。

为操作时方便，工作台内的用品应合理布局，原则是右手使用方便的用品放在右侧，左手使用方便的用品放在左侧，酒精灯放在中央。

2．超净工作台的消毒：

超净工作台在使用前可用75％酒精纱布将其内部揩擦一变进行初步消毒，然后打开工作台内的紫外线灯照射消毒20-30min。

照射杀菌完毕后关闭紫外线灯并同时打开风机，由于进入工作台内的空气是经过工作台上的除菌滤板过滤的，故工作台内是一个相对无菌的环境。

3．手的消毒：

操作时双手及前臂要伸入超净工作台内，事先双手必须用肥皂刷洗干净，然后用75％的酒精棉球擦拭消毒。

在夏季，手的刷洗和消毒应至肘部；在冬季，双手消毒后进入工作台前应戴上无菌的袖套。

4．操作过程中的消毒：

在超净工作台中开始操作时首先应点燃酒精灯，此后的一切操作如打开或加盖瓶塞、安装吸管皮头、使用吸管、使用各种金属器械等均要经酒精灯的火焰烧灼或在火焰旁边进行操作。

培养操作时，动作要准确教捷，不能用手触及器皿的消毒部分，如不慎触及，要用火焰消毒或更换。

开盖的培养液或培养用瓶应尽量保持斜位放置或平放，以避免瓶口长时间直立而增加细菌污染的机会。

吸取不同液体时应分别使用不同的吸管，不要混用以防扩大污染。

（二）细胞的传代培养

当培养瓶中的细胞已长成致密单层时即可进行传代培养，其操作步骤如下。

1．准备：

①将所需培养用具清洗消毒后放入超净工作台内并摆好，紫外线消毒30min。

②将已形成致密单层细胞的培养瓶从培养箱中取出放入超净工作台中。

③点燃酒精灯，在酒精灯旁将培养液倒入一小烧杯中。

2．消化：

①向培养瓶中加入消化液（0.25％的胰蛋白酶）500μL，轻摇培养瓶，使消化液湿润整个细胞单层，置室温下2-3min。

②翻转培养瓶使其底部朝上，用肉眼察看细胞单层，如细胞单层上出现空隙（约针孔大小）时即可倒去消化液；如果末见空隙，说明消化程度不够，可将消化时间稍延长；如果发现细胞已大片脱落，说明已消化过，在这种情况下不能倒出消化液，而应直接进入下步操作。

3．终止消化：

往培养瓶中加入3.5mL培养液以终止胰蛋白酶的消化作用，用吸管吸取瓶中的培养液反复冲击瓶壁上的细胞，直至全部细胞被冲下，轻轻混匀制成细胞悬液。

4．计数：

吸取少量细胞悬液于细胞计数器的小室中，光镜下计数，根据结果将细胞浓度调整至5×105/mL（细胞接种的密度亦可根据经验进行）。

5．传代：

吸取2mL细胞悬液移入另一培养瓶中，原培养瓶中留下2mL细胞悬液（其余弃去），并向每瓶中加入新培养液4mL，盖好瓶塞，轻轻摇匀后置37℃恒温箱中培养。

6．观察：

传代后每天应对培养的细胞进行观察，若细胞贴壁存活则称为传了一代，如培养液变酸发黄要及时更换。

七、注意事项

在整个细胞体外培养过程中，要始终保持无菌的概念，在操作的众多环节中要注意消毒灭菌，努力做到最大限度的无菌，严防细菌的污染，否则将导致细胞培养的失败。

八、实验报告

写出细胞传代培养的实验记录。

并记录传代培养后的贴壁细胞的生长情况。

九、思考

1．在细胞培养过程中，培养液的颜色为什么会变黄？

2．在细胞培养的过程中避免污染的关键环节有哪些？

实验二绿色荧光蛋白重组质粒的细胞转染

一、实验目的

1．了解细胞转染的实验原理

2．掌握细胞转染的方法

二、实验原理

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。

前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。

一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。

后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。

尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。

外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊。

除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高。

其中聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）是一种多用途的转染试剂对各种贴壁细胞有较高的转染效率、也适用于转染悬浮细胞和原代细胞。

可用于转染大分子DNA、小分子寡核苷酸和siRNA等。

PEI是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”（protonsponge）体。

这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞。

大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。

目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常作为核心组成成分。

本研究即取传代培养后细胞融合率在70%-90%的HepG2细胞，将构建好的含有绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因标记的重组质粒，转染细胞并使细胞表达EGFP报告基因。

三、实验材料

体外培养的人肝癌HepG2细胞株。

带有EGFP报告基因标记的质粒。

四、实验试剂

无双抗的PBS缓冲液，无双抗15%血清DMEM，胰酶，无血清无双抗的DMEM培养液。

五、实验方法

细胞转染操作（以6孔板或35mm细胞培养皿为例）

1．待细胞长至75%密度时（此时效果为最佳），准备转染。

2．取A、B两个EP管，分别加入100μl无血清无双抗DMEM，A管中加入8μLPEI转染试剂，B管中加入4μgDNA，分别孵育5min。

3．将A、B混合（A加入B中），用移液枪吹打混匀，复合物孵育15min。

4．取待转染的细胞，弃掉旧的培养液，用无血清无双抗DMEM清洗细胞两次（注意清洗时动作要轻），每孔中补加1.8mL无血清无双抗DMEM。

5．将PEI-DNA复合物逐滴滴加到细胞表面，边滴加边轻晃细胞培养板。

6．4h后更换2mL含有血清的培养液。

7．24h后检测细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。

六、注意事项

转染实验的成败与众多因素的影响有关，包括细胞状态、血清选择、抗生素的加入、转染用质粒的启动子的选择、质粒提取的质量、试剂保存等等。

①细胞状态：

对于体细胞系建议传代细胞传到第三代左右时就进行转染，取对数生长期状态良好的细胞。

根据细胞类型和培养基类型，选择合适的稳定的培养温度、湿度和CO2浓度，整个实验过程需要严格的无菌操作，防止细胞污染。

②血清选择：

选择质量稳定的血清。

尽量在无血清条件下进行转染，转染效率会比较高。

转染后换成新鲜的培养基进行细胞培养，可以有效提供细胞的存活率。

③抗生素的加入：

在转染培养