基因工程重组人干扰素共14页word资料Word下载.docx

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II型干扰素：

干扰素γ（IFNg）

活化的T细胞和NK细胞产生

功能：

免疫调节

Ø

提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力

增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性

抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答

趋化作用

抗病毒和抗肿瘤作用（次要）

2.根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。

免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。

●对巨噬细胞的作用：

IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；

此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。

●对淋巴细胞的作用：

干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。

在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；

而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。

在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。

IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；

但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。

IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。

●对其它细胞的作用：

IFNγ对其他细胞也有广泛影响：

①刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；

②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；

③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递呈作用；

④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。

二重组干扰素的临床应用

●广谱抗病毒活性（rhuIFNα）

慢性乙型、丙型、丁型肝炎；

疱疹、病毒性角膜炎。

●直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）

毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。

●免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）

●多发性硬化症rhuIFNβ

对已知基因序列的干扰素,基因文库的调用可以用其序列3'

端和5'

端部分事先用同位素

标记过的序列作为探针,通过杂交的方法进行调用。

由于干扰素基因的种属特异性不是很大,|可以用人的干扰素基因为同源探针,从鼠基因文库中调出相应的干扰素基因,其方法将在下文1中提到。

|

对于扰素基因的取用,不仅可以使用构建基因文库的方法,对已了解其氨基酸或核昔酸割

成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的DNA序列,再对其进行表达。

化学合|成方法包括固相合成法及液相合成法两大类。

与利用基因文库的方法相比,化学合成法比较|复杂,由于每加入一个核昔酸就会有一定比例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况,并且在l整个合成过程中这种错误不断积累,因此该方法适合比较短的基因,而对长的基因则有目的产|物含量低、产物纯化困难的缺点。

但它也有优点,如可根据研究的需要对一些氨基酸进行定点|突变,或根据宿主菌的特性,在不改变其氨基酸组成的情况下使用宿主的偏爱密码子,以提高|产物的产量。

对于不同亚型的干扰素,由于同源性较高,可以用相同的引物从诱导的小鼠细胞系中提取

mRNA混合物进行反转录和扩增,然后用亚型特异性探针对CDNA混合物进行Southern印迹,这样便可将序列上相差较小的同种、不同亚型的干扰素基因进行分离,为生产高纯度的单一干扰素提供了方法O

三、表达方法

随着对干扰素研究的深入,人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的

10~40位、78~107位、123~166位的A、B、C区,尤其是位于78和79位的氨基酸对抗病毒|活性十分重要。

而人IFNt1的121~136位对抗病毒活性作用较大,人IFN子的N端10个集|基酸也是保持其活性所必需的。

对干扰素结构的了解为更好地构建基因表达奠定了基础。

干|扰素最初是用其外源序列进行表达的,但近年来的研究表明嵌合表达的干扰素往往优于单一

干扰素,因此出现了较多的嵌合表达形式,并取得了较好的效果。

1.IFN-α的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、生产周期短、夕阳基因表达量高的优点,同时由于家蚕为真核生物,能对表达产物自行进行糖基化修饰,产生有生物活性的蛋白,并且在产物提取的过程中只要将家蚕进行匀浆,再进行抽提即可,操作上十分方便,因此,它在基因工程领域内被广泛应用。

下面便以人IFN,α的生产为例介绍家蚕表达体系在干扰素生产中的应用。

用家蚕核型多角病毒BIIINPV体外感染的家蚕传代细胞株BM-N通过噬菌斑法纯化得到BmNPV的τ3亚型。

利用从感染脂肪体mRNA制得的CDNA为探针,对其多角蛋白序列进行检验,其中10.5kb的EcoRI片段及3.9灿的HindE片段可与探针杂交,将10.5灿的EcoRI片段克隆到pBR322中,产生质粒pBmE360对其用HindE切,得到3.9kb片段,其中|含有多角蛋白全部序列（图123中为黑色框架）,将该片段插入pUC9的HindE位点,产生质|粒p9H18。

将p9H18用EcoRI切后于50UBAL31外切核酸酶缓冲液中23℃水浴10min,更|掐锺油油菲如n入07倍他烈的。

气mnlAdEDTA终止反应。

将截短的p9H18片段用HindEi切,并通过琼脂糖凝胶电泳分离2.7kb的Hind皿平头末端片段,将其插入pUC9即p9B310

的HindHI-SmaI位点O另外,将pBmE36的3.1峙的HindE片段连接到pUC8上,得到质粒p8H225,用EcoRI及AatE切,得含有多角蛋白基因下游3.1kb基因的3.5kb片段,将其连接到p9H18的4.7kb的EcoRIAatE片段上,产生杂交质粒p89B310,它在启动子下游含有多聚接头（EcoRI、BamHISmaI、SalI、PstI位点）。

将从基因文库中用183bp探针调出的在ATG后含有SmaI位点（即有序列CCCGGGATG）的IFNmαJ基因片段连接到p89B310上,便构建成质粒pIFN2B310。

将pIFN2B310与病毒基因组DNA便可共转染BM-N细胞系或家蚕幼体,其具体操作如下:

向2.5mL含有0.25molACaCl2、10μgBmNPVDNA及65μgpIFN2B310的溶液中加含0.28II1014NaCl、0.7mmoi/LNa2C03、0.7IIIII1014Na2HP04、50mmol/LEfEPE（pH7.1）的缓冲液,进行沉淀。

取0.45ml沉淀加至4.5mi含3×

106个细胞的培养液中,12h后换液一次,再培养4d,即可得到重组病毒BmIFN2B310。

用

两个噬菌斑单位的病毒感染3×

106个BM-N细胞或用50μL3×

105个噬菌斑单位的病毒溶液注人家蚕幼体,培养24h后收集培养液便可得到干扰素。

2.IFN-目的表达将人IFN-R基因HimdE片段插人载体pSV2-dhfr中SV40晚期启动子PL下游的PvuE位点。

用此重组质粒与带有黄瞟岭磷酸核糖转移酶（XGPRT）基因的质粒pSU--gpt共转染次黄瞟岭磷酸核糖转移酶（HGPRT）基因缺陷小鼠的骨髓瘤（sp24）细胞O经过霉盼酸及氨基喋岭培养基筛选,便可得到表达人IFN-R。

具体操作步骤如下:

将含有人IFN-

p基因的重组质粒pBV-92用EcoRI及HindE酶切,分别作为探针模板及插入片段,同时用PvuII切载体pSVZdhfr质粒,使其线性化后将外源基因插入。

将次黄瞟岭磷酸核糖转移酶基因缺陷的sp2/0细胞在含有10%小牛血清、10%青链霉素的DLfEM培养基中传3~4代后在小空斑瓶中培养24h,成半悬浮状,400r/勺1in离心5min将细胞沉积加入新鲜培养基,再培养2~4h。

转染液中含目的基因pSVHIF和标记基因pSVZgpt（比值为10:

1）,其中DNA浓度为20μg/IIIlo在2IIIol/LCaCl263阵、10mmolATris-HCl（pH7.1）428μL中缓缓加入2×

HeBs液（EEPES50mmol只L、NaCl280mmolA、Na2HP040.75mmolA、0.75IIlII1014Na2HP04,pH7.1）约500μL,加入sp2/0细胞培养物中,轻轻摇匀37℃孵育8h。

再更换为含有黄瞟岭250μg/mL、次黄瞟岭15μg/mL、胸昔10μg/mL、氨基蝶岭。

-2μg/mL、霉盼酸25问/mL的DhEM培养基,37℃cq孵箱中选择性培养。

一周后更换为含250μg/mL黄瞟岭的D;

旧M培养基,继续培养2周以上,检查IFN-P活性。

3.IFN-γ的表达以鼠干扰素MuIFN-γ为例（图12-3）。

用含人IFN-γ编码区基因的探针与噬菌体γMG9构建的鼠M600基因组DNA文库在20%甲酷胶中进行低严格性的杂交,膜用0.3molANaCl、0.03II1014拧棱酸纳及0.1%NaEbS04在室温洗涤两次。

将结合的噬

菌体用噬菌斑法纯化,提取DNA后,用多种限制性内切酶切,以1%葡聚糖凝胶电泳纯化后与人CDNA探针杂交,将γMG9中与探针可以杂交的10.5kb的BamHI片段亚克隆到pBR322的BaIIIHI位点,产生质粒pMG10.5。

通过电泳分出插入片段大于6000坤,即含有完整MuIFN-Y的质粒,用PvuII酶切,六个切点中有一个位于5'

端非编码区,取从此切点到第一内元中ClaI的348bp的片段以及用ClaI及BglH酶切得的MuIFNmγ3F端片段O将载体质粒p342E用EcoRI及BamHI酶切,并用聚合酶I将EcoRI切点补成平头末端,与以上制得的两个片段混合,一同转化大肠杆菌294,选出AIIIP抗性菌株,从中提取质粒即为含有干扰素编码基因的pSVEII111γ。

用表面活性剂右旋糖所活化COEL1细胞,将质粒转入并培养48h后离心,上清液中便含有干