Transwell实验超详细Word格式文档下载.docx

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应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：

〔1〕共培养体系：

小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，假设研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，那么应选择3.0µ

m以下孔径。

常用0.4、3.0µ

m。

我们实验室用的是0.4µ

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

〔2〕趋化性实验

可用5.0、8.0、12.0µ

m膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用：

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用：

将细胞种于上室，下室参加某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

〔3〕肿瘤细胞迁移实验

常用8.0、12.0µ

m膜，上室种肿瘤细胞，下室参加FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

〔4〕肿瘤细胞侵袭实验

m膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

上室种肿瘤细胞，下室参加FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶〔MMPs〕将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。

计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

2.肿瘤细胞侵袭模型

用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种〔引自司徒镇强?

细胞培养?

〕：

2.1体内癌细胞侵袭模型

2.1.1皮下移植侵袭模型

2.1.2肌肉内移植侵袭模型

2.1.3腹腔内移植侵袭模型

2.1.4小鼠肾包膜下移植侵袭模型

2.1.5鼠睾丸包膜下移植侵袭模型

2.1.6小鼠耳廓皮下移植侵袭模型

2.1.7鼠爪垫皮下移植侵袭模型

2.1.8视网内界膜侵袭模型

2.2体外癌细胞侵袭模型

2.2.1体外静止器官培养法

2.2.1.1半固体培养基单细胞器官培养法

2.2.1.2液体培养基单细胞器官培养法

2.2.2半体外半体内器官培养法

2.2.3单层细胞器官培养法

2.2.4瘤细胞球体器官培养法

2.2.4.1静止球体器官培养法

2.2.4.2旋转摇动球体器官培养法

2.2.5单层细胞侵袭实验模型

2.2.6Transwell侵袭小室测定法

可见，Transwell与侵袭实验之间并不能划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种方法。

所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。

由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法。

第二节Transwell侵袭实验

我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。

1.实验用品：

①Transwell小室：

多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比拟贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。

BD也有已包被好的，价格不清楚。

Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比拟常用的，好似是要自己铺胶，但据说每个小室本钱只有40左右，应该比拟适合中国国情。

下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。

linanping1979战友提供的价格：

coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µ

m，用于肿瘤的侵袭实验。

iceyxy战友提供的价格：

Millipore的8µ

m的50个1760RMB,0.4µ

m的2000多,是一次性的。

梅林战友提供的BD价格：

240RMB一块〔6.5um,24孔,12instert〕，好似是没胶的。

liguofan说国产的boyden30块一个。

jjyy提供的价格是：

corningcatNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人民币不到。

平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。

不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。

我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。

sword01战友提供的处理方法：

用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×

5min，蒸馏水3×

5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×

2。

因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。

以前的ChemiconECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很屡次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！

很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。

victoh战友对Millipore公司的millicell有比拟详细的讲解，链接如下：

:

//dxy/bbs/actions/archive/post/2082166_1.html

本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。

另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。

Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。

maojianwen战友的使用方法：

trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油〔注意用无色较稀的〕将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。

再照紫外。

②上层培养液：

上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需参加0.05%-0.2%BSA。

③细胞：

值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。

建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。

如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少那么数百，多那么数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。

另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。

④基质胶：

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国CollaborativeRsearch公司等。

CaoY战友的帖这么说的：

Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。

同样的东西在sigma叫ECM。

zhangyong1036战友提供的价格：

BD公司的matrigel1500左右。

如果购置的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购置了。

⑤下层培养液：

下层常用含5%－10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白参加下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最适宜的。

⑥细胞培养板：

常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。

细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。

但要注意，细胞培养板应当与购置的Transwell小室相配套。

⑦此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin，FN，Sigma有售），这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原〔collagen〕或明胶〔gelatin〕。

很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。

如果贴壁不好的话可以试试看。

linanping1979战友认为，如果培养时间很长〔>

24h〕，细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。

另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。

2．步骤

2.1Transwell小室制备

2.1.1无基质胶Transwell小室制备

①包被基底膜：

用50mg/LMatrigel1:

8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原〔collagen〕的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：

吸出培养板中剩余液体，每孔参加50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：

在上室的聚碳酸酯膜上参加稀释后的Matrigel（3.9ug/ul）60-80µ

l（注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

2.1.2有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列