基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法文档格式.docx

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一、研究内容

1、拟解决的关键科学问题

（1）利用酪氨酸、亮氨酸和吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，以及大肠杆菌和酵母筛选系统，在蛋白质中特定位点引入特殊的非天然氨基酸，包括荧光氨基酸、具有生物正交化学反应性能的非天然氨基酸、高效率的光交联氨基酸、较大双光子吸收截面的光转化氨基酸、磷酸化的氨基酸、含有19F或自由基的氨基酸等。

（2）针对已有筛选系统效率不高的问题，发展结构生物学和计算生物学的方法，为筛选体系建立理论指导。

（3）发展和优化以“无铜点击化学”为代表的活体蛋白质特异正交标记技术。

（4）发展和优化氟取代化学反应，以期在蛋白质中引入19F探针，并优化荧光标记基团的性能。

（5）发展蛋白质特异标记方法，揭示哺乳动物细胞和线虫细胞的运动机理。

（6）拓展蛋白质特异标记方法，发现药物新靶标，优化蛋白质药物的靶向性和半寿期。

2、主要研究内容

本项目的主要研究内容是以在蛋白质特定位点插入非天然氨基酸为主要研究手段，结合超高分辨率荧光成像、核磁和顺磁共振技术和结构生物学、蛋白质组学技术，深入研究细胞生物学和医药学研究中所涉及的重要科学问题。

（1）基因编码非天然氨基酸筛选平台的构建

通过人工进化的方法增加编码非天然氨基酸。

首先把无义密码子“UAG”确定为新的遗传密码，进而对天然的转运核糖核酸（tRNA）基因突变,使其含有反密码子“CUA”。

在此基础上从氨酰-tRNA合成酶突变库中，筛选出可专一结合这种tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。

然后再将生命体中mRNA上任意一个遗传密码取代为UAG,并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，从而在蛋白质中的相应位置插入具有特殊物理或化学性质的非天然氨基酸。

其简要技术路线见图1:

图1：

基因编码的非天然氨基酸的总体技术路线及正负循环筛选途径

（2）真核细胞蛋白质翻译起始机制的解析

eIF2α磷酸化作为蛋白质翻译起始的“总开关”，受到多种细胞胁迫信号的控制，与GCN2,PKR,HRI,PERK等因子发生直接作用，发挥尚待确证的复杂的生物功能。

我们将通过在eIF2α的特定位点引入磷酸化的氨基酸，解析eIF2α蛋白质与诸多细胞因子（如PKR）复合物的结构，并从分子机理，特别是磷酸化的角度阐明细胞响应胁迫信号的途径。

我们也将对蛋白翻译起始过程中起重要作用的细胞因子做荧光和光交联标记，以求获得对蛋白起始复合物动态调控机制的全面理解。

（3）细胞运动的分子机理解析

细胞中许多重要的生理活动，如细胞移动、胞吞、细胞浆移动等，都受肌动蛋白（actin）聚合的调控。

Spire是新的actin核化因子，具有非常重要的生理功能。

为了研究它们在胞内actin结构中的精确定位，我们将具有光交联活性的氨基酸插入到Spire蛋白中对它进行标记，发现新的相互作用蛋白并研究它们的动态相互作用，以及对其它核化因子调控的影响。

我们还将使用基因转导方法在线虫活体中引入正交氨酰tRNA合成酶和tRNA的稳定表达系统，使得在线虫活体中可以用TAG停止密码子编码非天然氨基酸。

通过这个技术研究线虫精子运动的活化因子和活化因子的受体蛋白偶联的囊泡运输与胞吐。

（4）GPCR类细胞跨膜蛋白的受体激活和信号转导机理的研究

细胞膜上的受体蛋白如GPCR是一类极为重要的跨膜蛋白，在信号转导过程中发挥着关键作用，也是目前药物研发领域中最为关注的靶点之一。

GPCR是一类典型的膜蛋白，其α螺旋链共七次跨膜，因而只有在活体细胞膜原位上进行研究才有意义。

这其中，如何在活体细胞内观察GPCR的状态、结构变化、偶联程度等都是研究的热点，对GPCR工作原理的动态跟踪更是目前人们最为关心的问题。

由于荧光蛋白的体积过大，对细胞跨膜蛋白的结构和性质所造成的干扰相当严重。

我们希望通过基因编码的非天然氨基酸和生物正交反应对GPCR进行定点特异地小分子荧光标记，从而在对GPCR结构和性质不造成干扰的情况下，特异、高效地使用FRET及单分子荧光等手段对GPCR的受体激活、信号转导机理等关键性问题进行研究，在分子尺度上对GPCR的工作原理及信号转导过程中的结构变化进行精确的观察与捕捉，解决现有研究手段无法涉及的难题。

（5）抗病毒药物靶标的发现

非天然氨基酸可以选择性插入到活体蛋白的任何位置，如果在病毒包膜蛋白上插入了具有光交联活性的非天然氨基酸，在病毒感染细胞的动态过程中，一旦受光照激发，该非天然氨基酸将会与病毒结合的细胞受体或辅助受体共价结合，从而捕捉新的抗病毒药物靶点。

由于光照交联是不可逆的，通过弱的蛋白-蛋白间的相互作用或者呈瞬间方式与病毒结合的蛋白，将会因此而富集起来，从而改善了蛋白免疫共沉淀方法的灵敏度和准确性。

将具有特殊化学、物理甚至生理性质的非天然氨基酸引入到病毒的外膜蛋白上,将有可能整体推动病毒学研究，发现大量的新的药物靶标，为新型抗病毒药物研发奠定基础。

以上几个方向既是国际上生命科学研究的热点，也是我们研究的重点内容。

二、预期目标

1、总体目标

本项目的总体目标是针对蛋白质科学前沿问题，设计和建立新的非天然氨基酸表达体系，将具有特殊物理、化学性质的非天然氨基酸表达到活细胞中目标蛋白质的特定位点，并通过系统优化，推动该方法成为实验室常规技术，使我国在该技术及应用方面跻身于国际前列。

2、五年预期目标

（1）突破性进展

通过本项目的实施，我们将在蛋白质特异标记的技术、理论和方法等方面取得突破性进展：

系统建立在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及线虫活体中具有普适性的引入非天然氨基酸的方法，全面发展荧光、核磁、光交联、光转化和磷酸化等蛋白质特异标记技术。

将蛋白质特异标记技术应用于超高分辨率荧光成像，特别是通过优化蛋白质荧光标记技术，力争使我们的空间分辨率的定位精度达到10nm，并做到实时活体观察。

将蛋白质特异标记技术应用于细胞运动的分子机理研究和药物靶标发现等，为我国在生命科学基础研究领域和药物研发应用领域带来重大突破。

（2）研究成果

通过基因密码的扩展，大力发展蛋白质荧光、核磁、顺磁、光交联、光转化和磷酸化标记技术，并将这些技术结合遗传学操作，应用于超高分辨率荧光成像、蛋白质动态相互作用、蛋白质磷酸化网络调控、细胞运动的分子机理探索。

②在蛋白质翻译机理方面，从结构生物学的角度解析氨酰tRNA合成酶与tRNA和底物氨基酸特异作用的机理，指导基因密码扩展技术的研究。

③发展以金属催化引入氟元素的方法学研究，对探索合成新型小分子荧光探针或非天然氨基酸，直接氟代蛋白质等提供化学手段的支撑。

④建立一种通用方法，将非天然基酸引入到活病毒的包膜蛋白上，开辟病毒受体发现的新途径。

⑤取得一批具有国际影响力的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表论文50篇以上，并力争在最高影响力的Science或Nature系列期刊上发表论文，发现1-2个在病毒和细菌感染中起重要作用的药物靶点，申请国内外发明专利6项以上。

培养一批有国际影响力的中青年学术带头人和学术骨干，培养博士研究生30名、硕士研究生60名。

系统优化蛋白质特异标记技术，为全国蛋白质研究提供一个全新的独特的研究方法，全面推进细胞生物学、化学生物学和医药学等领域的研究进展。

三、研究方案

1、总体学术思路

本项目总体学术思路是发展基于基因密码子扩展的蛋白质标记的新技术，利用在化学生物学、蛋白质翻译机理、蛋白质进化、以及医药学方面的良好工作基础，针对更多蛋白质科学前沿问题，设计和建立新的非天然氨基酸表达体系，将具有特殊物理、化学性质的非天然氨基酸表达到活细胞中目标蛋白质的特定位点，并通过系统优化，推动该方法成为实验室常规技术。

本项目的研究目标是通过超高分辨率荧光成像、单分子荧光、核磁及顺磁技术提高对蛋白质定位和相互作用检测的精度；

利用光交联技术研究具有重要意义的动态蛋白质识别和相互作用；

利用具有光化学活性的非天然氨基酸标记实现对蛋白质活性的高时空精度操纵。

2、技术途径

（1）对非天然氨基酸具有特异性的氨酰tRNA合成酶的高通量筛选

首先，修改大肠杆菌或酵母细胞内的遗传密码，使无义的“UAG”密码对应于感兴趣的非天然氨基酸。

然后，筛选对非天然氨基酸具有特异性的氨酰-tRNA合成酶，技术路线如下：

在目标细胞中引入一个外源的氨酰-tRNA合成酶和tRNACUA，使其保持活性且不与内源的氨酰-tRNA合成酶和tRNA反应（生物正交性）。

②改变编码氨酰-tRNA合成酶活性氨基酸的DNA序列，建立氨酰-tRNA合成酶基因突变库。

③对氨酰-tRNA合成酶突变库进行如图1所示的正负循环筛选，得到特异识别目标非天然氨基酸的合成酶变异体，使其只催化tRNACUA与非天然氨基酸间的氨酰化反应。

（2）基于非天然氨基酸标记的超高分辨率荧光成像

普通光学显微镜的分辨率和灵敏度一百多年来一直没有根本性的改善。

2006年美国科学家Betzig首次在Science杂志上提出了光敏定位显微镜（Photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM）的概念，其基本原理是将荧光分子标记在目标蛋白上，结合全内反射显微镜（TIRFM）和单分子定位技术，突破了光学显微镜分辨率的极限，得到细胞内蛋白纳米级分辨率的精确定位。

我们首先用可被特定波长光激活的荧光基团标记蛋白，调节405nm激光器使低能量照射细胞表面，一次激发出少量的荧光分子，其能量被高量子效率的EMCCD采集，通过高斯拟合，特异性地精确定位这些荧光分子。

然后用561nm激光器漂白这些分子，使之免于被下一轮的激光激发出来。

之后再次用405nm和561nm的激光分别激发－漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。

该循环经上百次后将得到细胞内所有荧光分子的精确定位，最后再将这些分子的图像合成到一张图上，得到一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，其定位精度可能突破10nm甚至达1nm的量级。

（3）基于非天然氨基酸标记的蛋白质复合物晶体生长和结构解析

首先我们将运用动态光散射仪，对获得的蛋白质和稳定蛋白质复合物样品的溶液状态进行分析，考察其是否处于均一状态，在不同条件（温度、浓度、pH等）下的稳定形态和凝聚状态；

同时运用溶液光谱（包括CD光谱和荧光光谱）方法分析蛋白质在溶液中的构象变化，综合各种因素初步确定适合于结晶实验的条件。

然后摸索晶体生长的条件，尝试大量不同的沉淀剂、蛋白质浓度、pH和缓冲体系、以及不同添加剂等，得到高衍射质量的晶体用于X-射线衍射分析。

一旦获得蛋白晶体，将利用X-射线衍射仪进行初步衍射实验，以帮助进行结晶条件的优化和低温冷冻条件的筛选。

具有高衍射能力的蛋白晶体将运用国内外同步辐射光源进行高分辨率的X-射线衍射数据的收集。

并运用单波长反常散射法、多波长反常散射法、同晶置换法、和分子置换法解析各种蛋白和蛋白复合物的三维晶体结构。

（4）基于非天然氨基酸标记的蛋白质19F核磁共振研究

溶液NMR技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用、测定蛋白质复合物三维结构的强大工具。

19F由于具有较强的核磁信号对环境敏感，而大多数生物大分子都不含氟元素，因此用19F标记蛋白可以产生很高的信噪比，在活细胞中获得蛋白质相互作用的动态信息和蛋白质复合物的动力学特征，而且对蛋白质结构和功能的扰动达到最小（19F和氢原子的半径类似）。

我们将选择分子量合适的蛋白质复合物，运用19FNMR信号，在活细胞中或接近生理条件的溶液状态下，研究这些蛋白质复合物，特别是低亲和力、瞬时蛋白质复合物的动态结构和性质、蛋白质之间相互作用的分子机制，探测蛋白质之间是否发生相互作用及其亲和力（Kd）、蛋白质之间的结合界面等。

（5）基于蛋白质特异标记的膜蛋白信号转导过程