新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程教学文案.docx

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新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程教学文案

新城疫冻干疫苗生产工艺流程

1生产用毒种制备

1.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5）,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。

选接种后72~120小时死亡、且病痕明显的鸡胚,分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水）,装于灭菌容器内。

将检验无菌、且对1%鸡红细胞凝集价≥1:

640（微量法1:

512）的鸡胚液混合,定量分装于安瓿中,冷冻保存。

注明收获日期,毒种代数等。

1.2毒种鉴定

1.2.1病毒含量按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36~37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度

的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚,逐个收获

鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:

160（微量法1:

128）者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥108EID50。

1.2.2纯净应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，分别按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》、《支原体检验标准操作规程》、《外源病毒检验标准操作规程》进行。

1.3毒种保存在-15℃以下保存,应不超过1年。

1.4毒种继代应不超过3代。

2制苗材料选择选择发育良好的9~11日龄SPF鸡胚作为制苗材料。

3制苗用毒液的制备

3.1接种取生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5）,每胚尿囊腔内接种0.1ml，接种后密封针孔，置36~37℃继续孵育，不必翻蛋。

3.2孵育和观察鸡胚接种后,每日照蛋一次，将在60小时前死亡的鸡胚弃去。

60小时后,每4~8小时照蛋一次,死亡的鸡胚随时取出,直至96或120小时,不论死亡与否,全部取出,气室向上直立,置于2~8℃冷却。

3.3收获将冷却4~24小时的鸡胚取出,用碘酊消毒气室部位,然后以无菌手术剥除气室部卵壳，剪开尿囊膜，吸鸡胚液,每若干个鸡胚的胚液混合为一组。

收获后的胚液置于灭菌瓶中，作好标识，留样后，结冻保存。

在收获胚液的同时,应逐个检查鸡胚,如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。

4半成品检验

4.1无菌检验经处理过的胚液,每组分别取样,按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进行无菌检验,应无细菌生长。

4.2病毒含量测定

按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36~37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚,逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:

160（微量法1:

128）者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量>107EID50者可用于配制疫苗。

5配苗及分装

将检验合格的若干组鸡胚液滤过,混合于同一容器内,按规定羽份,加一定比例的蔗糖脱脂奶粉作稳定剂,使其最终蔗糖含量为2.5%，脱脂奶粉含量为5%，同时加入适宜的抗生素,充分摇匀,定量分装,每羽份病毒含量应≥106EID50。

分装后迅速进行冷冻真空干燥。

6成品检验

6.1物理性状

6.1.1外观检查疫苗瓶上的标签，打印出的羽份或头份、生产批号、有效日期清晰可见、位置适当。

瓶上的铝盖稳固不松动。

6.1.2眼观检查将疫苗拿到与眼平行位置观察呈微黄色，海绵状疏松团块，然后再轻微振动，疫苗松动并与瓶壁分离，判为合格。

6.1.3溶解性检查用稀释液注射到疫苗瓶内，经轻微振动，疫苗应迅速完全溶解，无粘块或粘团出现，判为溶解性良好。

6.2无菌检验按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进行，如有菌生长，应进行杂菌计数，并作病原性鉴定（按《杂菌计数和病原性鉴定操作细则》进行）和禽沙门氏菌检验每羽份非病原菌数应不超过1个（按《禽沙门氏菌检验法》进行）。

6.3支原体检验按《支原体检验法》进行，应无支原体生长。

6.4鉴别检验

6.4.1选择发育良好的10日龄SPF鸡胚10只，划出尿囊腔接种部位。

6.4.2将疫苗用无菌生理盐水稀释至105.0EID50/0.1mL，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，尿囊腔接种，每胚0.1mL。

6.4.3将接种后鸡胚用石蜡封孔后，置37℃继续孵育，观察120小时，在24~120小时内应不引起特异死亡，且至少存活8只，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。

6.5外源病毒检验按《外源病毒检验法》进行。

6.6安全检验下列方法任择其一。

6.6.1用鸡胚检验将疫苗用无菌生理盐水稀释，尿囊腔内接种10日龄鸡胚10只，每胚0.1ml（含10个使用剂量），接种后24~72小时，鸡胚死亡率应不超过20%为合格。

如死亡率超过20%，可用20个鸡胚重检1次，重检结果死亡率仍超过20%，该批疫苗判为不合格。

6.6.2用鸡检验用2~7日龄SPF雏鸡20只，合成两组，第1组10只，每只滴鼻接种0.05mL（10个使用剂量）；第2组10只，不接种作为对照，两组在相同条件下分别饲养管理，观察10日，应无不良反应。

如有非特异性死亡，免疫组与对照组均不超过1只。

6.7效力检验下列方法任择其一。

6.7.1用鸡胚检验

6.7.1.1鸡胚选择选择发育良好的10日龄SPF鸡胚15个，划出尿囊腔接种部位，作出批组及滴度标记，每一滴度接种5个。

6.7.1.2疫苗稀释将疫苗按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1mL，再作10倍系列稀释至10-7。

6.7.1.3接种分别取10-7、10-6、10-5三个稀释度尿囊腔内接种鸡胚各5个，每胚0.1mL，用石蜡封孔。

6.7.1.4孵育置37℃继续孵育至120小时，每天上、下午各照检1次，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚，随时取出放在2~8℃冰箱中，至120小时取出全部活胚放在2~8℃℃冰箱中24小时。

6.7.1.5凝集价（HA）测定与计算鸡胚半数感染量（EID50）将冷却鸡胚取出，将同一稀释度的死亡鸡胚液等量混合，分别测定红细胞凝集价；将活胚逐个收获鸡胚液，分别测定红

细胞凝集价，HA≥160（微量法128）者判为感染，计算半数感染量，每羽份≥106.5EID50（国家标准每羽份≥106.0EID50），判为合格。

6.7.2用鸡检验

6.7.2.1鸡的选择选取30-60日龄健康易感鸡（血凝集抑制价应≤4）10只。

6.7.2.2疫苗稀释将疫苗按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释成每0.05mL含1/100使用剂量。

6.7.2.3免疫及攻毒每只鸡滴鼻接种0.05mL，10~14日后，连同条件相同的对照鸡3只，各肌肉注射鸡新城疫北京株强毒104.0ELD50，观察10-14日，对照鸡全部发病死亡，免疫鸡至少保护9只为合格。

6.8剩余水分测定按《剩余水分测定方法》进行，应符合规定。

6.9真空度测定按《真空度测定方法》进行，应符合规定。

鸡新城疫低毒力活疫苗生产工艺流程图、主要过程控制点和控制项目

注：

*为关键控制点为控制项目

抽样

检验

装箱入库

贴签

-15℃冷冻保存

收获

*SPF种胚

种蛋选择

种蛋消毒

前孵化

分装

冻干

粗洗

纯化水洗

胶塞

保护剂配制配制

*脉动蒸汽灭菌

出箱

干燥

接种途径

接种剂量

无菌检验

病毒含量

分装前、中、后无检

配苗

无菌检验

加塞

压盖

物理性状

安全检验

无菌检验

外源病毒检验

效力检验

*后孵化及照蛋

*接种

*冷蛋

铝盖

分装瓶

纯化水粗洗

注射水洗

照蛋时间

培养温湿度

冷蛋时间

冷蛋温度

*隧道烘箱灭菌

清洗

*灭菌

新城疫灭活疫苗生产工艺流程

1生产用毒种制备

1.1毒种繁殖将毒种用灭活生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5），尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。

选接种后72～120小时之间死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。

将检验无菌，且对1%鸡红细胞凝集价在1：

640（微量法1：

512）以上的鸡胚液混合，定量分装于安瓿瓶中，冷冻保存。

注明收获日期、毒种代次等。

1.2毒种鉴定

1.2.1病毒含量按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36~37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度

的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚,逐个收获

鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:

160（微量法1:

128）者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥108EID50。

1.3毒种保存在-15℃以下保存，应不超过6个月。

1.4毒种继代应不超过3代。

2制苗材料选择选择发育良好9～10日龄的易感鸡胚作为制苗材料。

3制苗用毒液的制备

3.1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5），每胚尿囊内接种0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

3.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。

此后，每4～6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24小时。

3.3收获

3.3.1鸡胚液的收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术破除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（谨防卵黄破裂），吸取胚液。

对每个鸡胚在

吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。

死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定血凝价，血凝价低于1：

160（微量法1：

128）者应弃去。

同时作无菌检查，应无细菌生长。

收获的胚液灭活前在2～8℃左右保存，应不超过5日。

3.3.2鸡胚胎儿收获及浸出液的制备在收获及胚液的同时，取病变胎儿，去头、脚，用生理盐水洗2～3次，磨碎，制成（1：

5）～（1：

10）乳剂，加适宜的抗生素适量，然后离心或以4层纱布一层铜纱网滤过，置自然沉淀1～2日，然后取样作无菌检查。

以上清夜作为配制双相油乳剂疫苗用。

4灭活将上述无菌胚液以4层纱布及一层细铜纱网滤过，混合于一个大玻璃瓶内，吸出数毫升样品备测毒价。

其余胚液和鸡胚浸出液分别计量加入10%甲醛溶液，随加随摇，使其能充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1%。

加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶口附近黏附的病毒未能接触灭活剂。

然后在37℃灭活16小时（以瓶内温度达到37℃开始计时）。

期间振摇3～4次。

在2～8℃保存，应不超过1个月。

5半成品检验

5.1无菌检验取灭活的胚液及鸡胚浸出液分别按附录448进行，应无菌生长。

5.2灭活检验取10日龄无新城疫病毒抗体的鸡胚6个，每个接种灭活胚液0.23ml，每日照蛋2次，观察5日，鸡胚非特异死亡不应超过1个。

对所有胚液分别测定血凝价，应不出现血凝，认为灭活完全。

如有可疑，应将可疑胚液进行重检，重检不合格者报废。

鸡胚浸出液也按照上述方法检查。

5.3毒价测定将灭