rtpcr注意事项文档格式.docx

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realtimePCR与reversetranscriptionPCR（反转录PCR）

相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种RTPCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitativeRT-PCR）”

RT-PCR技术相关试剂

　oligo:

多聚体，相当于mRNA引物

　　AMV（M-MLV）：

逆转录酶

　　dNTP：

脱氧核苷酸

　　RNase：

RNA酶抑制剂

　　PCRBuffer：

RT-PCR缓冲液

　　MgCl2：

2价镁离子

PCR各步骤的目的

（一）预变性：

　　破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。

此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

（二）变性--退火--延伸循环：

　　①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

　　②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为

反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

（三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟

　　用PCR仪扩增时,（变性.退火,延伸）循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：

　　1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。

（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。

　　2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。

通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。

3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：

在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

RT-PCR的注意事项

在做Northern等杂交实验、构建Cdna（互补DNA）文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。

真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNAPCR得到我们需要的基因呢？

因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。

真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。

所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。

要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。

1．RNA的提取

RNA的提取其实原理很简单：

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

1．1分离高质量RNA

成功的cDNA（DNA）合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo（dT多聚体RNA引物）选择性分离poly（A）+RNA（聚

（一）+RNA）。

不管起始模板是总RNA还是poly（A）+RNA，都可以检测到扩增结果。

另外，分离poly（A）+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。

然而，当分析稀有mRNA时，poly（A）+RNA会增加检测的灵敏度。

1．2RNA提取的最大影响因素-RNA酶

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。

而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子。

因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；

另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。

在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。

这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。

而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

1．3常用的RNA酶抑制剂

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：

是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

*异硫氰酸胍：

目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

*氧钒核糖核苷复合物：

由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：

从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin（阻抑蛋白）是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

*其它：

SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

1．4防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作

*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。

RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。

*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase（RNA酶抑制剂）带入各种容器内或污染用具。

尽量避免使用一次性塑料手套。

塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。

*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips（技巧）、tubes（管子）等，以防交叉污染。

例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNaseH9（多聚酶和核酸内切酶）、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。

而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。

*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。

多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。

用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。

*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。

*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。

*塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

*配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

1．5RNA提取的一般步骤

RNA提取的一般步骤是：

破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA

破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。

洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA应该尽量低温。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。

从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。

为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。

用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。

来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。

当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：

加入NaAc至0.3M，12,000×

g离心5分钟。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

TRIZOL是有毒物，接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤，一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。

TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。

尽管如此，为达到最佳效果，建议保存在2-8°

C的环境下。

∙TRIZOL:

（RT-PCR）半定量检测bcr-ablmRNA表达收集经终浓度为10μmol/L的反义及正义寡核苷酸作用48小时的K562细胞，用RNA提取液（TRIzol）提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计进行RNA定量，取1μgRNA用引物OligodT15反转录成cDNA。

2．RT-PCR

RT-PCR是指将逆转录（R