第十五章 细胞工程与作物育种Word文档下载推荐.docx

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在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，进而从中分化、发育出整个植株的技术。

植物组织培养技术的重要理论基础是植物细胞的全能性——在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植株。

Gamborg曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5种类型：

•愈伤组织培养

•悬浮细胞培养

•器官（胚、花药、子房、根和茎等）培养

•茎尖分生组织培养

•原生质体培养

外植体（explant）是指用来进行培养的植物体的某一部分组织的统称。

一、培养基及其组成

1、培养基的种类和特点（表1-5）

培养基是植物组织培养中的主要部分，除了培养材料本身因素外，培养基的种类和成分等直接影响培养材料的生长和发育，应根据培养材料的种类和培养部位选择适宜的培养基。

培养基的种类很多，不同的培养基有其不同的特点。

基本培养基：

MS

二、培养基的配制

1、配制母液（高浓度储备液）

•大量元素－10倍母液

•微量元素－100倍或1000倍母液

•铁盐母液－200倍

•有机化合物母液－0.1、1.0、10mg/ml（分别配制）

•激素母液－0.1、0.5、1.0mg/ml（分别配制）

2、配制培养基

（1）混合各成分母液

（2）熔化琼脂

（3）将

（1）与

（2）混合，定容

（4）调节PH值

（5）分装

（6）灭菌

（7）放置备用

3、无菌操作

消毒－无菌操作－无菌培养

第二节

细胞和组织培养与作物育种

一、体细胞克隆变异

二、单倍体细胞培养

三、幼胚培养

四、种质保存

五、植物快繁、脱毒

六、人工种子生产

1.概念

体细胞变异是指植物组织和细胞培养物在培养过程中产生的变异。

变异体（variant）：

不加任何选择压力而筛选出的变异个体。

突变体（mutant）：

经过施加某种选择压力所筛选出的无性系变异。

2.组织培养获得变异体或突变体的方法

（1）组织培养之前的变异及其选择

有些变异发生在植株某一部分的细胞中，将这部分变异的细胞从植株上分离下来进行培养，使之再生为植株。

例:

利用体细胞变异育成非洲菊新品种。

体细胞的遗传突变在自然条件下时有发生，将发生变异的体细胞培养再生成植株。

在红花品种中选黄花变异系，及在白花品种中选粉红花变异系，均获成功。

（2）组织培养期间的变异及其选择

组培过程中对培养物施加某种处理，使之发生变异后进行选择。

　　Gengenbach,B.G.（1975）用玉米小斑病的T小种毒素在感病的玉米培养物中进行筛选，经过愈伤组织培养以及毒素的继代培养，最后获得了抗性愈伤组织并诱导出再生植株。

选择过程:

未成熟胚（授粉后大约10d的幼胚）固体培养基培养愈伤组织培养基中加入毒素继代培养，经几个周期选择抗性愈伤组织诱导再生植株移栽至土壤，生长期间鉴定其抗病性和雄花育性成熟（获得抗病和保持不育性个体）

　　（3）组织培养后的选择和鉴定

在培养基中加入诱变剂，诱发产生变异，将再生植株种在田间或温室内进行选择，选择出有益的变异类型。

这种选择多局限于形态性状，如株型、叶色以及其他可见的性状。

花药、花粉和小孢子培养

优点：

•后代快速纯合

•提高选择效率

•排除杂种优势对后代选择的干扰

•创造遗传研究的材料

•筛选突变体

用途：

•克服远缘杂种胚的早期败育

•提高远缘杂种的成苗率

•使种子不育的植株得以繁殖

•使胚发育不全的植株获得后代

•克服种子休眠

•克服柑橘类合子胚不能生长的现象

随着社会的发展，人类需求日益多样化，但由于环境的污染、土地被大量开垦，种质资源日渐减少甚至丧失。

研究植物物种资源长期稳定的保存方法，一向为国内外所重视。

但植物种类繁多，品种更是难以数计，用常规方法保存几乎是不可能的，而组织培养技术使之成为可能。

自1975年Nag和Street首次成功地用超低温保存胡萝卜悬浮培养细胞以来，已对百余种植物材料进行了超低温保存的研究，并发展了快速冷冻法、缓慢降温法、分步降温法、干燥冷冻法等多种降温冷冻保存法。

保存的植物材料包括茎尖、芽、胚状体、幼胚、花粉、悬浮培养细胞、原生质体等。

优点:

（1）在较小空间内便可保存大量克隆的植物资源，即所谓"

营养体种子"

;

（2）具有很高的繁殖系数;

（3）避免外界不利气候及其他栽培因素的影响;

（4）在隔离昆虫、病原体和病毒的条件下保存;

（5）由于不带有已知病毒和病原体，有利于国际间物种种质的交换与交流。

1、快繁

目前采用快速繁殖技术进行工厂化大规模商品生产的植物有香蕉、甘蔗、草莓、康乃馨、按树等。

采用快速繁殖可拯救珍、稀、濒危植物。

如安徽黄里软子石榴从残存几株繁殖到几万株；

樱桃珍品中的太和樱桃用成年树的芽离体培养成苗；

用快繁技术保存棉花的野生种等。

快速繁殖技术的优点

（1）快速。

采用常规的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生产几株或几十株，但用组织培养的方法则每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株。

（2）周年生产。

花卉组织培养快速繁殖是在实验室中进行，因条件可控，所以不受季节限制，可以全年进行连续生产。

而常规的无性繁殖则受季节限制，只能在花卉生长季节进行繁殖。

（3）经济效益高。

花卉组织培养快速繁殖所需要的空间小，在一个200平方米的培养室内一年可生产上百万株试管苗。

2、脱毒

已知大多数作物，尤其是用无性营养繁殖的作物，供体都可能感染一种或几种病毒或类病毒，现已发现的病毒在500种以上。

草莓有62种病毒和支原体类菌质体，侵染马铃薯的病毒有30种左右。

在我国种植的马铃薯、香蕉的品种中多已感染病毒，这是这些作物长期低产和品质不佳的主要原因。

现在发现许多有性繁殖作物中有1/10还可种子传递病毒，导致有性繁殖的作物也深受病毒之害。

病毒在植物体内能周身分布，长期无性繁殖致使病毒积累、危害程度日益严重。

与其他病原体相比，危害植物的病毒种类很广，也最难以防治。

因为植物的细菌和真菌病害可用杀菌剂防除，虽有病毒抑制剂的研究（如孔雀绿、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等），但由于病毒的复制增殖与植物的正常代谢密切相关、药害严重，至今末能应用。

•自50年代发现通过植物组织培养方法可以去除植物病毒以来，现在生产上已被广泛应用，并将其纳入无性繁殖植物的常规良种繁殖的一个重要程序。

由于不需用化学药剂防治，可减少污染、防止公害，因而具有良好的经济效益和社会效益。

• 

采用这一技术生产无病毒种苗可以同时除去真菌、细菌和线虫的寄生，因此产量大幅度增加，最高可增产300%，平均增产也在30%以上。

人工种子是指将细胞培养所产生的体细胞胚或类似物，经过有机化合物的包埋而形成的能在适宜条件下发芽的类似于天然植物种子的颗粒体。

人工种子的优点

•培养条件可以人为控制，具有省地省工可直接在田间播种等优点。

•在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等。

•用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率。

•一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。

人工种子存在的问题

•许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。

•现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀。

•人工种子的贮藏有待进一步完善。

第三节

植物原生质体培养和体细胞杂交

　　原生质体：

指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。

就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。

一、原生质体培养的利用途径

•通过原生质体培养可以制造单细胞无性系。

•原生质体可以作为基因转化的受体，使之接受外源遗传物质（如细胞器、染色体或DNA片段等）产生新的变异类型。

•利用原生质体进行许多基础性研究，如细胞生理、基因调控、分化和发育等。

•细胞融合即体细胞杂交。

二、原生质体的分离

•机械分离法：

先对材料进行质壁分离处理，然后切割。

•酶法分离：

一步法将果胶酶和纤维素酶等混合处理材料，直接分离获得原生质体。

二步法先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。

三、原生体的培养

培养方法：

平板培养、液体浅层培养、悬滴培养、液固双层培养、琼脂糖包埋、看护培养。

培养条件：

密度—

光照—黑暗

温度—22～25℃

四、细胞融合（体细胞杂交）

1、概念

•体细胞杂交（somatichybridizatioin）又称原生质融合（protoplastfussion），是指两种原生质体间的杂交。

•胞质杂种（cytohybrid）:

是指体细胞杂交过程中有意识地去除（或杀死）某一亲本的细胞核，得到的是一个亲本细胞核和两个亲本细胞质的杂种细胞。

2、体细胞杂交的特点：

有可能使有性杂交不亲和的双亲之间杂交成功。

也就是说，在体细胞水平上的杂交，其双亲间的亲和性或相容性似乎有所提高，因而有可能扩大杂交亲本和植物资源的利用范围。

体细胞杂交与有性杂交的区别：

•体细胞杂交不是雌雄配子间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合。

因此，杂交的产物中将包含有双亲体细胞中染色体数的总和及全部细胞质。

•有性杂交的杂合子内仅包含双亲体细胞中染色体数目的一半，而且其细胞质的绝大多数都来自卵细胞。

　　3、体细胞杂交的技术环节

①原生质体的分离和培养；

②原生质体间的融合；

③融合后杂种细胞的选择；

④诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生植株。

4、杂种细胞的鉴别和选择

　在两亲细胞融合试验中，可以产生同源融合体（A×

A或B×

B）、异源（A×

B）和非融合体（A或B）。

选择异源融合体即杂种细胞的方法：

（1）用选择性培养基创造条件

（2）互补形态

（3）异核体机械分离和核型分析

（4）体细胞杂种和胞质杂种的鉴别

（1）用选择性培养基创造条件

　　用选择性培养基创造专门使杂种细胞能够生长的条件。

卡尔逊（Carlson,1972）育成的世界上第一个烟草体细胞杂种就是采用这种方法，已知两亲的原生质体均不能在无外源激素的培