重组质粒原核表达.docx

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重组质粒原核表达

实验九表达质粒的构建与诱导表达

第一节原核表达概述

基因工程的研究一方面是取得基因的表达产物，另一方面是研究基因结构与功能的关系，最终都涉及目的基因的表达问题。

表达载体（expressvector）是指本身携带有宿主细胞基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。

也确实是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用。

外源基因在宿主（受体）细胞内是不是表达和表达水平受到许多因素（调控元件）的制约：

1．正确的阅读框架

为了取得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应维持一致。

阅读框架是由每三个核苷酸为一组连接起来的编码序列，外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架当中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。

2．目的基因有效转录的启动子

启动子（promoter）是DNA链上一段能与RNA聚合酶结归并能起始mRNA合成的序列，

它是基因表达不可缺少的重要调控序列。

原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，别离称为一35区和一10区。

一35区的序列为TTGACA，一10区序列为TATAAT。

此两序列之间的最正确间距为17bp。

可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。

由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必需用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。

原核表达载体启动子的转录常常是能够操纵的，即一样情形下不转录，而受诱导剂诱导时就能够转录，带动外源基因的高效表达。

目前经常使用的启动子：

如大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调剂操纵；trp等启动子是色氨酸操纵子启动子，受trpR编码的阻遏蛋白调剂操纵；tac启动子，由lac启动子的一l0区和trp启动子的一35区融合而成，汇合了lac和trp二者优势，是一个很强的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调剂；lacUV5启动子是经紫外线诱变改造后的lac启动子，该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够够启动转录；噬菌体的λPL、R启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度灵敏的阻遏蛋白受温度调控的很强的启动子；T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，而且十分专一，只被T7RNA聚合酶所识别；SV40启动子、多角蛋白启动子和花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子。

3．转录终止子

构建表达载体时，为了稳固载体系统，避免克隆的外源基因干扰表达载体的稳固性，一样要在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA转录终止子（terminator）。

不然合成的

mRNA太长，不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。

原核基因的转录终止序列包括依托Rho蛋白和不依托Rho蛋白两种。

不依托Rho的终止信号序列都含发夹结构，结尾为连续串T及YRTCTG。

4．mRNA有效翻译的SD序列

在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点（ribosomebindingsite，RBS）也调剂着mRNA的翻译，一个是起始密码（AUG或GUG），另一个是位于起始密码上游3～11个核苷酸处的由3～9个核苷酸组成的一段保守序列AGGAGGU，这段序列富含嘌呤核苷酸，称为SD序列。

而核糖体和mRNA的结合是由SD序列和与起始密码子AUG之间的距离决定的。

因此，SD序列和它的起始密码子AUG之间的距离是阻碍外源基因在原核生物中表达量高低的重要因素。

SD序列与AUG距离9个碱基最为适合，其间距离太长或太短都会阻碍目的基因的表达，有时由于这种距离的阻碍，蛋白质合成水平会相差2000倍以上。

且SD序列与AUG之间的碱基最好是A或U，一3位最好是A。

5．转录、翻译后的适当修饰和加工

真核生物基因表达的产物往往需要进行适当的修饰加工，但由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工系统相当不完善，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰。

而且不同宿主其修饰系统也不一样，因此选择宿主时应注意。

6．信号序列（signalsequence）

在原核细胞中，合成的蛋白可否分泌到细胞外与mRNA编码区上游的一段信号序列有关。

这段编码序列翻译的15～30个氨基酸为蛋白质N端的信号肽，它能携带蛋白质跨膜并分泌到细胞外。

脂双层和负电荷的质膜通过和信号肽的疏水彼此作用和电荷的吸引是信号肽能跨膜分泌的要紧缘故。

当信号肽携带后面的蛋白质跨膜分泌后，信号肽即被质膜上的信号肽酶切除取得有功能的成熟蛋白质。

因此依照不同的需要，人们构建了不同的在原核细胞中高效表达的载体，这些载体通常具有以下几个特点：

①有一个强的原核启动子及双侧的调控序列；②位于读码框上游的SD序列与起始密码子AUG之间有适合的距离；③在外源基因和启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依托ρ因子的转录终止区。

一样表达载体都具有多克隆位点，对表达载体和外源基因用相同的两种酶双酶切后，再用T4DNA连接酶把外源片段连入表达载体中，通过酶切、PCR鉴定，若是插入的片段大小和方向与外源基因一致，那么成功构建了重组子。

将克隆的基因插入适合载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方式一样称为原核表达。

这种方式在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：

易于生长和操纵；用于细菌培育的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各类各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各类特性的质粒可供选择。

可是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而阻碍表达蛋白的生物学活性及构象。

 原核表达载体一样为质粒，典型的原核表达载体应具有以下几种元件：

（1）选择标记的编码序列；

（2）可控转录的启动子；

（3）转录调控序列（转录终止子，核糖体结合位点）；

（4）一个多种单一限制性内切酶位点序列；

（5）宿主体内自主复制的序列

原核表达的一样程序：

1取得目的基因

2预备表达载体

3将目的基因插入表达载体中（测序验证）——表达质粒的构建

4表达质粒转化相应的宿主菌

5外源基因的诱导表达（诱导靶蛋白的表达）

6表达蛋白的分析

原核表达的大体操作步骤举例：

一、试剂预备

一、LB培育基。

二、100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：

2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,μm滤膜抽滤，-20℃保留。

二、操作步骤

（一）取得目的基因

一、通过PCR方式：

以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物别离引入不同的酶切位点），PCR循环取得所需基因片段。

二、通过RT-PCR方式：

用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环取得产物。

（二）构建重组表达质粒

一、载体酶切：

将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

二、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三） 取得含重组表达质粒的表达菌种

一、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，依照重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作挑选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

二、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。

不然应挑选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（四）诱导表达

一、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃留宿培育。

二、按1∶50比例稀释留宿菌，一样将1ml菌加入到含50mlLB培育基的300ml培育瓶中,37℃震荡培育至OD600≌（最好，大约需3h）。

3、取部份液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度mM作为实验组,两组继续37℃震荡培育3hr。

4、别离取菌体1ml,离心12000g×30S收成沉淀，用100μL1%SDS重悬，混匀,70℃10min。

五、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。

三、注意事项

一、选择表达载体时，要依照所表达蛋白的最终应用考虑。

如为方便纯化，可选择融合表达；如为取得天然蛋白，可选择非融合表达。

2、在构建表达质粒时，要注意使外源基因与载体DNA的起始密码相吻合时，使其处于正确的阅读框架当中。

3、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反映时，对转录和转译进程中密码结构的阅读不能发生干扰。

四、评议

1．表达质粒的构建的实验操作大体上与扩增质粒的构建相同，只是构建表达质粒时为了高

效表达外源基因，一样目的基因应与载体的相关DNA片段相融合。

融合蛋白在大肠杆菌中的表达的优势如下：

融合蛋白N端由正常的大肠杆菌本身序列所操纵。

容易取得高效表达；融合蛋白往往不被大肠杆菌视为异己蛋白，更为稳固。

2．表达载体与目标基因在体外重组完成后，必需导人特定的受体细胞如：

BL21（DE3），使之无性繁衍，直接改变其遗传性状。

3．在外源基因克隆到表达载体时，应注意其序列的ORF的正确与否，它直接决定其编码

的氨基酸序列，而且直接阻碍蛋白质的功能。

若是ORF内碱基对发生缺失突变或插入突变，即插入或缺失非3的倍数的碱基对，那么ORF就可能发生改变，而取得一个截然不同的蛋白质产物，这种转变确实是移码突变。

若是发生突变形成了终止密码子，就会产生提早终止的、不完整的蛋白质，即无心义突变。

其可分三种情形：

琥珀突变（amber），原先的密码子突变成UAG；赭石突变（ochre），原先的密码子突变成UAA；乳白石突变（opal），原先的密码子突变成UGA。

4．为了使外源基因在原核细胞中高效表达应利用蛋白酶缺点型的宿主，如用lon营养缺点

型减少外源蛋白的降解。

因为黄嘌呤核苷（1on）是大肠杆菌合成蛋白酶的要紧底物。

lon营养缺点型宿主不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。

第二节外源基因的诱导表达

一、实验目的

了解诱导外源基因表达的大体原理，学习和把握诱导外源基因表达的经常使用的方式，为SDS-PAGE分析做预备。

二、实验原理

外源基因在原核生物中高效表达除有适合的载体外，还必需有适合的宿主菌和必然的诱导因素。

宿主菌的选择对外源基因的表达是相当重要的，因为外源基因（专门是真核基因）在细菌中的表达往往不够稳固，常常被细菌中的蛋白酶降解。

因此有必要对细菌菌株进行改造，使其蛋白酶的合成受阻，从而使表达的蛋白取得爱惜。

实验中经常使用的宿主菌是通过改造的JMl0九、BL21等大肠杆菌菌株。

通常表达质粒不该使外源基因始终处于转录和翻译当中，因为某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将阻碍细菌的生长。

为此，宿主细胞的生长和外源基因的表达是分成两个时期进行的，第一时期使含有外源基因的宿主细胞迅速生长．以取得足够量的细胞；第二时期是启动调剂开关，使所有细胞的外源基因同时高效表达，产生大量有价值的基因表达产物。

在原核基因表达调控中，阻遏蛋白与操纵基因系统起着重要的开关调剂作用，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，阻止基因的转录。

加入诱导物后；使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。

依照表达载体的不同，外源基因表达常采纳化学诱导与温度诱导两种方式。

pET及pBV系列表达载体是最近几年来被普遍应用的两种诱导方式的代表性原核表达系统。

1．化学诱导

关于pET系列表达载体，当目的基因被克隆在T7转录和翻译信号操纵的正确相位后，加入IPTG进行诱导，使宿主菌表达T7R