中药复方研究探究 室细胞跟分子实验操作指南资料Word文档格式.docx

中药复方研究探究 室细胞跟分子实验操作指南资料Word文档格式.docx

《中药复方研究探究 室细胞跟分子实验操作指南资料Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中药复方研究探究 室细胞跟分子实验操作指南资料Word文档格式.docx（30页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

1.无菌室的打扫与灭菌

1）定期打扫无菌室：

先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰新洁尔灭擦拭。

2）培养箱定期灭菌：

用75%酒精擦拭孵箱内部（最好同时将孵箱中各隔层拆下），再用紫外灯照射。

（对于含有自动灭菌程序的孵箱，先用75%酒精擦拭后，再启动其灭菌程序）

3）实验前细胞房与超净台的灭菌：

打开紫外灯，照射30min左右。

4）每天实验结束后，应及时清理垃圾筒中垃圾。

2.实验人员的无菌准备

1）实验前应用肥皂洗手。

2）穿好实验服，更换拖鞋。

3）75%酒精消毒双手。

3.操作台中的无菌操作

1）在超净台经紫外照射灭菌后，实验人员应注意在通风条件下进行实验操作。

2）在通风条件下，先点燃酒精灯，再用酒精棉擦拭超净台桌面（尽可能的大于自己所用台面），同时保持工作区域的宽敞。

3）实验人员应清除无菌区与有菌区的概念。

超净台虽经紫外照射除菌，但也是相对的，因此，操作时应靠近酒精灯火焰。

4）操作时应尽量减少手臂的运动，尽可能避免左右手交叉（近手操作）：

把需要有用的工具和试剂尽可能放在手边，以酒精灯为界，左手用的东西放在酒精灯的左边，右手用的东西放在右边。

例如，一个右手操作者要从试剂瓶里吸取液体，则移液枪应放在右手，而枪头与试剂瓶都应放在左手边。

5）带入操作台中的物品，应注意：

刚经高压灭菌的可以直接放入超净台中；

临时带进来的，应先用75%酒精擦拭或喷洒后再放入超净台，这类物品包括各种装培养基、缓冲盐等的瓶子、试管架、胶塞等。

6）要养成用镊子操作的习惯：

拿取饭盒中的各类物品，尽可能用镊子去夹取；

对于小的物品，如瓶盖、枪头、eppendorf管，应避免用手直接去拿取。

7）打开的瓶子，应放在酒精灯火焰旁，瓶盖反放朝上。

禁止在打开试剂瓶包括瓶盖的正上方进行实验操作（包括跨越敞开的开试剂瓶上方去拿取东西）。

8）实验结束后，依次将个人物品带出超净台（包括废液缸），用酒精棉擦拭桌面，熄灭酒精灯，最后调小风力并关掉日光灯。

9）废液的处理：

先将废液缸中的液体倒入下水道，再将废液缸中其他东西倒入垃圾篓中（尽可能避免将大量废液倒入垃圾篓中）。

4.其他注意事项

1）保持试剂瓶与桌面成约45℃时打开盖子或移取液体：

这样可以尽量减少空气的污染以及在移液时产生最少的气溶胶。

2）在打开试剂瓶、拿取瓶盖、镊子及玻璃移液管等时都要用火烧下：

灼烧不是为了灭菌，只需在火焰上燎1~3秒即可。

灼烧一下瓶口和移液管等，使颗粒固定在表面和制造一个向上的气流，以减少掉落颗粒的数量。

3）定期检查CO2钢瓶的压力。

4）定期检查孵箱中水盘中的水量及是否污染（最好每周更换一次，用无菌水）

第3节培养用品的清洗

1.玻璃器皿的清洗

1）自来水或肥皂水刷洗。

2）烘干，泡酸：

烤箱中烘干，浸入洗液（重铬酸钾120g：

浓硫酸200ml：

蒸馏水1000ml，先将重铬酸钾溶于水中，待凉，将浓硫酸缓慢倒入其中，边倒边搅拌）中，浸泡12小时，然后从酸缸里捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

3）烘干、包装：

洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装，待用。

2.橡胶与塑料制品的清洗

橡胶和制品通常处理方法是：

先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序。

1）针式滤器帽不能泡酸液：

用NaOH泡6-12小时，或者煮沸20分钟（指新的滤器）。

用过的滤器，每次用完后及时用自来水、蒸馏水、双蒸水冲洗干净，晾干就可。

2）新胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。

然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。

最后装入铝盒内高压灭菌。

3）.塑料培养瓶，培养板及胶头：

用洗涤剂洗干净后，用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，凉干。

75％酒精浸泡过夜，超净台中吹干，紫外照射后使用即可。

3.注意事项

1）注意人体的防护和器皿的完全浸泡：

A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。

B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。

C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。

第4节培养用品的消毒灭菌及灭菌锅的使用

造成组织细胞培养失败的主要原因之一是发生污染，特别是微生物污染。

在细胞培养的实验过程中，有一半以上任务是培养用品的消毒灭菌。

防止培养物污染主要通过培养用品的消毒灭菌与实验人员的无菌操作技术来完成。

目前本实验中采用的消毒灭菌方法主要是湿热消毒、紫外线消毒及过滤除菌消毒。

1.湿热消毒（121度，30分钟）

常用且很有效的消毒方法，一般使用高压蒸汽灭菌锅进行。

高压蒸汽灭菌锅装置严密，输入蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而升高，当压力增至103~206kPa时，湿度可达121.3-132℃。

高压蒸汽灭菌法就是利用高压和高热释放的潜热进行灭菌。

适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、玻璃器皿、培养瓶/皿、细菌培养基等。

1）操作方法如下：

1灭菌前，应检查灭菌锅中的水量，保持水位高于加热圈2cm左右。

2将拟灭菌的物品随同盛装的桶放入灭菌器内；

将盖子上的排气软管插于铝桶内壁的方管中；

盖好盖子，拧紧元宝螺丝，勿使漏气。

3打开放气阀，调节变压器至220V，开始加热。

4排出锅内冷空气，关闭放气阀（一般以空气急速排出2分钟左右为准），使压力逐渐上升至120kPa（压力表中的指针应在中间位置左右），调节变压器，维持压力30分钟左右。

·

5灭菌完后，应先关掉灭菌锅的开关，拔掉电源插头，再将变压器调零。

6灭菌锅压力降至“0”后，约10分钟，再慢慢打开灭菌锅盖子。

如果突然开盖，冷空气大量进入，蒸汽凝成水滴，使物品潮湿，且玻璃类易发生爆裂。

2）注意事项：

1灭菌前必须检查锅内水位。

（水量与小爪齐平）

2灭菌时，各包裹不宜过大过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。

3灭菌时，对于螺旋盖的瓶子，应使瓶口半松；

对于胶塞的瓶子，应插入注射器针头，保持瓶子内的冷空气顺利排出。

灭菌完后，应立即拧紧瓶塞或拔掉针头（多时须贴上胶布）。

4液体灭菌时，液体体积以不超过3/4为宜。

5针式滤器及过滤装置，在进行高压灭菌时，要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），滤膜光滑一面是正面，否则起不到过滤的作用。

3）不能高压灭菌的有：

1含有热不稳定组分，如血清、维生素、抗体和蛋白质等（如BSA）。

2哺乳动物、植物和昆虫的培养基。

3含HEPES的溶液。

4含有去垢剂的缓冲液，如10%SDS，会因为沸腾而溢出。

5含有二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇（BME）。

6避免物质沉淀、变色及分解：

葡萄糖不能和含有氨基酸或磷酸盐的组分一起灭菌；

磷酸盐不能和含有氨基酸或者其他矿物质盐溶液（Ca2+）一起灭菌；

含有矿物质盐的溶液不能和琼脂一起灭菌；

不要在pH6.0一下灭菌琼脂溶液。

2.紫外线消毒

紫外线直接照射消毒是目前实验室中常用的方法之一，主要用于实验室房间里的空气、超净工作台、桌椅表面等消毒。

同时，紫外线消毒也是我们常用于塑料培养皿（塑料培养板、培养瓶等）的消毒。

3.过滤除菌消毒

对于不宜采用高压灭菌的液体，如培养基、血清等，可采用过滤方法以去除细菌等微生物。

本实验室中主要采用抽滤式装置和针孔注射式滤器两种方法。

具体采用那种方法，主要依赖于滤液的体积，对于体积较大的，如1L培养基及缓冲液等，可采用抽滤式装置，对于体积较小的（<

200ml），可采用针孔注射式滤器。

不管那种方法，我们采用的滤膜均为0.22μm孔径的滤膜。

第5节常用缓冲液、胰蛋白酶消化液及培养基的配制

平衡盐溶液是组织细胞培养中常用的基本溶液，用于维持渗透压，调节以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。

目前，在细胞培养及实验过程中，我们经常会用到一些缓冲有磷酸盐缓冲液（PBS），Hank’s，D-Hank’s，KRPH，HBSS等缓冲液。

各种缓冲液的主要不同点在于NaCl的浓度、离子的浓度及缓冲系统的不同。

1.PBS配制（1L）：

NaCl8g

Na2HPO4·

12H2O2.08g

KCl0.2g

KH2PO40.2g

注意：

在800ml双蒸水中依次溶解上述试剂，调节pH至7.4，然后定容至1L。

用途：

1）配制EDTA、胰酶、胶原酶；

2）冲洗组织和细胞。

保存：

高压灭菌，4℃保存。

2.Hank’s配制（1L）：

12H2O0.134g

KCl0.4g

KH2PO40.06g

MgSO40.1g

葡萄糖1g

CaCl20.14g

A：

在800ml双蒸水中依次溶解前六种试剂，为A液。

B：

用小体积（2ml左右）溶解CaCl2，为B液。

C：

在持续搅拌下，将B液缓慢滴加进A液（不宜滴加过快，负责会产生沉淀）。

D：

定容至1L。

冲洗组织和细胞。

过滤除菌，4℃保存。

3.KRPH配制（1L）：

NaCl7.54g

KCl0.36g

KH2PO40.16g

MgSO40.15g

NaHCO30.42g

HEPES2.4g

CaCl20.28g

在持续搅拌下，将B液缓慢滴加进A液（不宜滴加过快）。

4.胰蛋白酶消化液配制：

在进行原代培养过程中需分散组织、细胞，在传代中要使细胞脱离附着的底物时均常使用消化液。

本实验室采用的消化液主要有两种：

0.25%胰蛋白酶消化液、0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液。

具体采用什么消化液，操作者应根据自己实验情况，相应调整胰蛋白酶的浓度，比如在进行人脐静脉内皮细胞（HUVEC）原代分离时，采用的是0.1%的胰蛋白酶消化液。

注意，配消化液所用溶液均为无Ca2+、Mg2+的缓冲液（如PBS）。

1）0.25%胰蛋白酶消化液（100ml）

称取0.25g的胰蛋白酶；