PCR实验室操作流程Word文档下载推荐.docx

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聚台酶链式反响（PCR〕可对特定核苷酸片段进展指数级的扩增，而实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反响体系中参加荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进展定量分析的方法。

在实时荧光定量PCR反响中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：

荧光探针和荧光染料。

我们目前是使用TaqMan荧光探针的检测原理：

PCR扩增时在参加一对引物的同时参加一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；

PCR扩增时，Taq酶的5’一3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团别离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加〔图一〕。

这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

三、操作步骤

〔一〕试剂配制

1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV-DNA检测试剂盒。

查看外包装盒（包括生产批号、有效期），无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反响液与Taq酶（核对核酸提取液、HBVPCR反响液与Taq酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致）〔图1〕，不一致如此不可使用，需更换新的试剂。

室温平衡20min，完全融化后2000rpm离心备用。

2、核酸提取液的分装

〔1〕l离心管架置于超净工作台内（开机前用紫外线消毒30分钟），用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架〔注意应夹住离心管外壁，不能碰到管内壁），摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，离心管个数为n（n=样本数+对照品+质控品）。

完成后将镊子放回原位〔图2〕。

〔2〕用移液器准确吸取核酸提取液50ul分装至0.5m1离心管中（左上角第一排开始，从左住右依次参加〕。

因核酸提取液内含固体沉淀颗粒物，为使颗粒均匀分布，故每次取样时都要用移液器反复吸打3-4次〔图3〕。

分装完毕后将移液器量程归位。

〔3〕加完一架后用右手拿镊子将离心管拿起，左手大拇指和中指夹紧离心管下部，然后用食指将盖子盖上，顺序为：

从右下角第一个开始，从右住左依次盖上〔图4〕，离心管盖全部盖完后，通过传递窗转移至标本处理区。

3、HBV-DNA反响液的配制

每批需设置空白对照、阴性对照、临界阳性对照〔同时检测低值阳性质控品，如此无需再检测临界阳性对照〕、阳性质控品、阳性标准品。

所需每批需配制数n=样本数+对照品+阳性标准品+质控品，每个测试反响体系配制如下表：

试剂

HBVPCR反响液

Taq酶

用量〔ul〕

〔1〕〔图5〕。

〔2〕取出离心后备用的HBVPCR反响液和Taq酶，按上述要求配制后用旋涡振荡器振荡混匀5-10sec，然后再用离心机2000rpm离心10sec备用〔图6〕。

〔3〕从操作台面上拿取HBV-DHA试剂配制盒（可选用空余的200u1枪头盒）至超净工作台内，打开配制盒并用记号笔在相应的孔位右旁按顺序编号〔图7〕。

编号规如此为：

样本扩增反响管对应的孔位按相应的样本流水号编写、阳性质控品反响管对应的孔位编“Q〞〔如有高值如此标为H，低值为L），阴性对照品孔位编“-〞，临界阳性对照对应的孔位编“±

〞，空白对照对应的孔位编“B〞，1号标准品对应的孔位编“S1〞，2号标准品对应的孔位编“S2〞，依此类推。

〔4〕编号完毕后，用右手拿起镊子夹起反响管（ABI7300使用的是八联一薄壁反响管，镊子应夹住反响管外壁，不可接触到内壁。

按〔图8〕所示方向依次将所有反响管（反响管数=n）隔列摆放到配置盒上。

〔5〕从离心机中取出已混好Taq酶的PCR反响液，用移液器（量程调至36ul），准确吸取反响液并按从上到下、从左至右的顺序依次加至反响管中，注意：

吸头应深入到反响管底部，放液时应缓慢，切勿形成气泡〔图9〕。

全部加样完毕后将配制盒通过传递窗转移至样本处理区。

〔二〕标本处理

1、标本、质控品与对照品的处理

〔1〕从冰箱冷冻室取出HBVDNA阳性质控品、阴性对照品，室温平衡20min待其完全融化。

ADICON

P0001

2016-01-12

〔2〕核对标本和原始申请单的条形码和检验项目，无误后依次粘贴上相应的流水号，如

2、从传递窗中取出试剂准备区分装好核酸提取液的离心管架，移至生物安全柜内在管盖上用记号笔写上阿拉伯数字1、2、3、......，阳性质控管标上“Q〞〔如有高值如此标为H，低值为L），阴性对照管标上“-〞，临界阳性对照管标上“±

’，。

离心管盖上标记的是1，就表示该管要参加流水号为P0001的标本〔图10〕。

注意：

每个离心管的编号方向都应朝向管口开启的方向。

〔图11〕

3、去除标本管盖：

将标本从前处理取至标本准备区，按排列顺序依次去除样本管上的橡胶塞。

具体操作为：

在生物安全柜中，左手拿起血清管并固定，右手拇指和中指涅紧橡胶塞，右手食指轻轻顶住橡胶塞顶部凹面，逆时针方向轻轻旋下橡胶塞后废弃于装有消毒液的垃极桶〔图12〕。

〔注意：

手指切勿接触到血清管口或碰触到血清，如手套上有血清如此需与时跟换新的手套；

待所有样本管盖都去除完毕后，也需更换新的手套。

）

4、样本与对照品的处理：

a、左手拿起样本，用量程为200u1调至50u1的移液器准确吸取样本（注：

为保证样本的均一性和吸样准确，每次取样时需用移液器将样本吸打3-5次；

吸样时移液器套筒不可接触到样本管内壁）〔图13〕

b.吸样完毕后，将样本管放至另一试管架中（切勿不可将样本放回原试管架位）〔图14〕。

前面所述样本流水号和离心管编号的对应关系拿起相应的离心管，打开离心管盖（注：

单手操作，食指和中指固定离心管，拇指稍向后上方发力打开管盖，手指切勿碰到离心管口和管盖内侧）〔图15〕。

d.管盖完全打开后，用左手食指、拇指和中指固定离心管，将吸头中的样本全部打入离心管底部，轻轻吸打混匀3-5次。

〔图16〕

e.加样完毕后弃枪头干盛有消毒液的垃极桶中（注：

一个吸头只能用于一个样本的吸样，禁止使用一个吸头重复吸取不同样本）。

同时盖上离心管盖并放回离心管架（放回的位置需另起一行，切不可放回原位），继续处理下一个样本。

对照品和质控品同病人样本一样处理。

〔图17〕

f.待一架离心管全部加样完成后用振荡混匀器充分振荡混匀10-15秒。

g.左手将混匀后的离心管转移至恒温金属浴上（注：

离心管需对称的放置在恒温金属浴相匹配的孔槽内），用计时器计时，100℃误差不超过±

1℃〕干浴10min（误差不超过±

30sec）。

〔图18〕

干浴时用离心管架置于加热的离心管上，防止离心管盖因加热爆开导致标本间的污染〔图19〕。

h.十分钟后〔前后不超过半分钟），右手用摄子夹起橡皮垫从恒温金属浴中拿出离心管〔图20〕。

I.将上述离心管按顺序对称放入低温高速离心机转子孔内，摆放离心管时要将离心管开口朝内，盖上转子盖与离心机盖后，12,OOOrpm离心10min（注：

离心时需在转子孔内放置0.5m1离心管专用适配器〔图21〕。

j.待离心完毕后，取出离心管并按编号顺序依次摆放在离心管架上（参照〔图10〕的排列方式）并4'

C冰箱保存备用；

假如当夭不使用，如此应保存在一20'

C条件下，使用前置室温平衡20min，再以12,OOOrpm离心10min。

5、待全部样本加样完毕更换手套，左手用镊子夹起反响管盖的一侧的延伸段（不要碰到管盖），然后用右手大拇指从左住右依次盖紧管盖（不要碰到其他未盖的反响管口）〔如图22〕。

6、将反响管连同试剂配置盒通过传递窗传至扩增分析区。

〔三〕扩增分析

1、打开扩增仪专用电脑，待电脑完全启动进入操作界面后再开启定量PCR仪主机电源。

a.按压托盘以打开它〔图23〕。

b.将反响管按顺序纵向放置放入反响板架（注：

在反响管总数不足96个时，应对称的将反响管放置在反响板架上，两边放置要求尽可能对称，可以防止热盖下压时发生倾斜，也可以使各反响管受力和受热都比拟均匀）〔图24〕。

c.按压托盘以关闭它。