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）b）化学法;

（通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎）

有机溶剂法、表面活性剂、酸、碱处理法、EDTA螯合剂法。

c）物理法:

（通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎）。

包括渗透压冲击法、冻结-融化法、干燥法。

细胞破碎的目的：

细胞室生物体结构和功能的单位，通常人们所需要的物质有些分泌于细胞外，如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培养液或所处环境中，用

适当的溶剂就可以提取;

有些则存在细胞内部，如核蛋白和相关酶类鞥，其所含的酶又有游离酶和结合酶之分，前者游离在细胞质之中，后者则与细胞则与细胞器紧密结合。

欲提取存在于细胞内的物质就需要把细胞破碎。

一班动物细胞膜比较脆弱，极易破碎。

而植物和微生物的细胞壁比较牢固，需要在提取钱进行专门的破碎细胞操作。

2）抽提的含义，方法。

以及抽提有效成分的影响因子有哪些.

抽提的含义：

抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。

经过处理的原材料中的有效成分可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。

抽提的影响因子

在抽提阶段，pH值、溶剂的极性和离子浓度、水解酶、温度、搅拌、氧化、金属离子、因子抽提液与抽提物的比例等，可明显影响有效成分的性质和数量。

3）浓缩的方法：

沉淀法、吸附法、超过滤法、透析法、加密呀蒸馏法、冰冻干燥法。

第二章:

沉淀分离技术

1）盐溶:

一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶

2）盐析:

而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析.

二）简答题

1）蛋白质的沉淀方法：

盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、选择性变性沉淀法、非离子多聚物沉淀法。

2）简述盐析法分离蛋白质的原理，以及影响盐析的因素，欲提高盐析效率应采取什么措施。

原理:

盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析.

影响蛋白质盐析的因素：

（1）蛋白质浓度,

（2）离子强度和离子类型的影响,（3）pH的影响,（4）温度的影响

操作过程中注意以下事项可以提高盐析效率:

（1）添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不断搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀；

（2）同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。

盐析通常与等电点沉淀法配合使用。

（3）选择好温度，一般在室温下进行；

（4）蛋白浓度不易过高，一般25－30g/L；

低浓度盐析，可用离心分离；

高浓度盐析（70－80％），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；

盐析沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。

3）沉淀核酸有几种方法？

在操作过程中如何防止其分子被损伤？

常用的沉淀分离法有：

（1）有机溶剂沉淀法

（2）等电点沉淀法

（3）钙盐沉淀法

（4）选择性溶剂沉淀法

制备具有生物活性的核酸，必须采用温和的条件，避免过激的反应环境，如过酸或过碱，避免剧烈搅拌，要求在低温下进行操作，并防止核酸酶的作用，可加入酶变性剂抑制其活性。

第三节利用膜的分离技术

一）名词解释

1）透析：

透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。

2）浓缩：

使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。

3）脱盐／纯化：

脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。

通过溶剂交换，可最有效地去除溶液中的小分子物质，并逐渐分离纯化出大分子物质。

具体方法

3）微滤：

以多孔薄膜为过滤介质，压力差为推动力，利用筛分原理使不溶性粒子（0.1-10um）得以分离的操作。

操作压力0.05-0.5MPa。

4）超滤：

是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物理筛分过程。

其截断分子量一般为6000到50万，孔径为几十nm，操作压0.2-0.6MPa。

5）反渗透;

利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂（通常是水）而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。

操作压差一般为1.5-10.5MPa，截留组分为小分子物质。

6）纳滤;

纳滤技术是反渗透膜过程为适应工业软化水的需求及降低成本的经济性不断发展的新膜品种，以适应在较低操作压力下运行，进而实现降低成本演变发展而来的。

1）膜分离技术的概念，特点，分类。

•概念：

用半透膜作为选择障碍层，利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。

膜分离的特点

•①操作在常温下进行；

•②是物理过程，不需加入化学试剂；

•③不发生相变化（因而能耗较低）；

•④在很多情况下选择性较高；

•⑤浓缩和纯化可在一个步骤内完成；

•⑥设备易放大，可以分批或连续操作。

•因而在生物产品的处理中占有重要地位

2）常见的膜分离方法有哪几种？

以及膜生物分离法有哪些应用？

透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、渗透气化

该技术可以用在一下午领域;

治理污水，人体透析，蛋白质分离，海水净化

凡是有机物分离的应用，都可以使用膜生物分离法，高效环保

•3微滤，超滤，纳滤，反渗透分离技术的特点，及适用范围？

微滤应用

1）除去水/溶液中的细菌和其它微粒；

2）除去组织液、抗菌素、血清、血浆蛋白质等多种溶液中的菌体；

3）除去饮料、酒类、酱油、醋等食品中的悬浊物、微生物和异味杂质。

•超滤应用

•蛋白、酶、DNA的浓缩

•脱盐/纯化梯度分离（相差10倍）

清洗细胞、纯化病毒除病毒、热源

•纳滤的应用

•

（1）小分子量的有机物质的分离；

•

（2）有机物与小分子无机物的分离；

•（3）溶液中一价盐类与二价或多价盐类的分离；

•（4）盐与其对应酸的分离。

反渗透工业应用包括：

•海水和苦咸水脱盐制饮用水；

•制备医药、化学工业中所需的超纯水；

•用于处理重金属废水

•用于浓缩过程，不会破坏生物活性，不会改变风味、香味。

包括：

食品工业中果汁、糖、咖啡的浓缩；

电镀和印染工业中废水的浓缩；

奶品工业中牛奶的浓缩。

4）几种膜分离技术的分离范围

•第四章：

层析分离技术

•一、）名词解释

•1）层析技术:

利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。

•2）固定相：

固定相是层析的一个基质。

它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。

•　　3）流动相：

在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。

柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。

•　　4）层析：

以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。

•5）分配系数K：

指某一组分在固定相与流动相中含量的比值

•6）迁移率Rf：

指某一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离的比值。

•7）吸附剂：

凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质。

•8）吸附物：

能聚集于吸附剂表面的物质称为被。

•二、）简答题

•1）吸附层析的概念、原理、吸附剂的选择依据、操作步骤。

•吸附层析：

是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法。

原理：

吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的，故在一定的条件下，被吸附物可以吸附和离开吸附剂表面，吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的。

•吸附剂的选择：

常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。

羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者。

应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。

•洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。

合适的洗脱剂应符合下列条件：

•①纯度较高；

②稳定性好；

③能较完全洗脱所分离的成分；

•④黏度小；

⑤易和所需要的成分分开。

操作步骤包括，装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测。

2）分配层析的概念和原理，以及

分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。

原理：

在分配层析中，通常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂沿固定相流动构成流动相，某溶质在流动相的带动下流经固定相时，会在两相间进行连续的动态分配。

当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时，分配系数越小的组分，随流动相迁移的越快。

两个组分的分配系数差别越大，在两相中分配的次数越多，越容易被彻底分离。

3）纸层析的原理以及操作方法，和展开剂的展开方式，以及Rf值得影响因素。

纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂（与水不相混溶或部分混溶）作为流动相。

展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。

由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。

操作方法：

1）样品的处理;

应尽可能除杂纯化。

调节到一定的pH值，浓度应该适宜。

2）点样：

将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线线上然后用点样器隔2-3cm点样。

4）展开:

有下行法、上行法、和环形法、双向展开法等四种方式。

5）显色：

为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂或紫外光显示。

6）定性分析：

为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。

7）定量分析：

有剪洗比色法）、直接比色法、面积测量法。

Rf值得影响因素：

1.物质的结构和极性：

物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。

极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。

2.滤纸：

不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同。

所以同一种物质在不同型号的滤纸上层析时，所得到的Rf值也不相同。

3.层析所用的溶剂：

同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同

4.pH值：

样品的pH值会影响物质