CLONTECH酵母双杂中文版文档格式.doc

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（十一）酵母单杂交文库的构建和筛选 28

（十二）酵母双杂交文库的构建和筛选 30

方法A:

通过酵母配对（YeastMating）来筛选目的蛋白 30

方法B:

通过共转化的方法筛选目的蛋白 35

（十三）分析阳性相互作用结果 38

（十四）问题解决指南 44

（十五）参考文献 47

（十六）相关产品 50

附录A:

双链cDNA合成的典型结果 51

附录B:

酵母感受态的制备—LiAc法 52

附录C：

单杂交对照载体信息 53

附录D：

双杂对照载体信息 54

表格列表

TableI．BDMatchmaker酵母菌株的基因型 11

TableII．BDMatchmaker酵母菌株的表型 11

TableIII．单杂交系统的载体 14

TableIV．双杂交系统的载体 15

TableV．各BD-MatchmakerDNA-BD载体的比较 19

TableVI．RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系 24

TableVII．单杂交共转化的对照实验的设置 29

TableVIII．单杂共转化对照实验：

期望的结果 29

TableIX．双杂交转化的对照实验的设置 33

TableX．双杂交配对筛选的对照实验的设置

TableXI．双杂交共转化的对照实验的设置

TableXII．双杂交共转化的对照实验：

期望的结果

TableXIII．用于PCR筛选菌落的AssemblingMasterMixs

图片列表

Figure1．使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4

Figure2．使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4

Figure3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤 5

Figure4．构建和筛选BDMatchmaker酵母单杂交和双杂交文库 6

Figure5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因 12

Figure6．BDMatchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选 16

Figure7．BDMatchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选 17

Figure8．用BDSMART技术合成高质量的dscDNA 21

Figure9．BDCHROMASPIN纯化柱和收集管 26

Figure10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库 27

Figure11．为双杂交筛选AD融合文库 32

Figure12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略 39

Figure13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用 42

Figure14．用对照用人胎盘PolyA+RNA合成双链cDNA 51

Figure15．p53HIS对照载体的图谱 53

Figure16．pGAD-Rec2-53AD对照载体的图谱 53

Figure17．pGADT7-RecTAD对照载体的图谱 54

Figure18．pGBKT7-53DNA-BD对照载体图谱 54

Figure19．pGBKT7-LamDNA-BD对照载体图谱 55

（一）介绍

BDMatchmakerTMLibraryConstruction&

Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BDMatchmakerTMSystems和BDSMARTTMcDNASynthesis的技术，只需要用任何组织的1μgpolyA+RNA或totalRNA就能构建cDNA文库。

通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BDMatchmakerSystems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。

单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验

单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。

这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA绑定结构域的确定。

通过BDMatchmakerOne-HybridSystem你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白

在BDMatchmakerOne-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。

一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。

DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长

双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理

双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。

在一个BDMatchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4DNA（DNA-BD）绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域（AD）序列融合表达（Fields&

Song,1989;

Chienetal.,1991）。

当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2,HIS3,lacZ,MEL1）这样的报告菌株中相互作用，DNA-BD和AD相接近结合，并激活报告基因转录（Figure2）

DNA-BD和AD的融合序列是将cDNA序列克隆进酵母表达载体pGBKT7和pGADT7-Rec载体中来实现的。

pGBKT7表达了与GAL4DNA-BD融合的蛋白，而pGADT7-Rec表达与GAL4AD相融合的蛋白。

在酵母中，两种融合基因在组成型启动子PADH1下高水平表达的。

其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。

pBridge载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。

单杂交和双杂交实验分析的生物学基础

单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA绑第结构域在结构上和功能上是分开的。

这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA序列并激活下游报告基因的转录（Figure1和Figure2），BDMatchmakersystems使用的GAL4的转录激活域与DNA绑定域是被完全阐述的的转录因子（Zhu,L.&

Hannon,G.J.,2000.）

双杂和单杂文库的建立和筛选

双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，（注：

有两个步骤遵从同样的流程）。

如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD融合载体。

第二步是使用试剂盒所提供BDSMART试剂从你所抽提polyA和totalRNA建立cDNA文库。

就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BDMatchmakercDNA文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA分离、cDNA合成、AD融合文库构建。

这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。

我们也提供一种BDMatchmaker文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD融合文库。

请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BDMatchmakercDNA文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。

在单杂分析中我们推荐使用pGADT7-Rec2andpHIS2等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克隆。

其次是cDNA合成，把cDNA克隆到BDMatchmakerAD克隆载体中建立一个GAL4AD融合文库，如果是建立双杂文库是pGADT7-Rec载体，单杂则是pGADT7-Rec2载体。

克隆在细胞内通过同源重组来进行的，这一步利用酵母替内高效重组系统使dscDNA和相应的GAL4AD质粒融合。

采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能紧密的完成，而不需要任何的细菌转化和扩增步骤。

简单的把cDNA文库和相应的BDMatchmaker载体转化到酵母中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双杂作用。

Figure3.酵母单杂和双杂筛选的一般步骤，更加详细单杂和双杂筛选流程图，请参考Figures6and7.

Figure4.BDMatchmakerTM单杂和双杂文库筛选与构建.

如这个图表所示，Asthisdiagramshows,重组介导克隆使文库构建和筛选更快捷高效，尽管这里没有显示，双杂文库能通过酵母融合筛选（细节参照SectionXII）.BDSMARTTM的cDNA合成和扩增，请参照SectionIX.pGADT7-Rec被用于双杂文库构建和筛选而pGADT7-Rec2被用于单杂文库构建和筛选。

被pGADT7-Rec[2]所显示的两个相关载体有不同复制元件。

更多的信息请参照SectionX和相关的载体信息包.i

（二）试剂盒内试剂列表

此试剂盒包含有足够试剂能制备5次单杂或5次双杂文库。

去离子水、BDCHROMASPIN柱,、NaCl溶液、缺省（DO）补充物、NaOAc、LiAc、PEG、TEBuffer,、YPDPlus培养基在室温下保存；

.酵母菌株、对照PolyA+和BDSMARTIIIOligo保存在–70°

C，其他试剂储存在–20°

C.下。

cDNA第一条链合成

cDNA扩增

Trial–SizeBDAdvantageTMPCR试剂盒

cDNA纯化

单杂交文库构建

双杂交文库构建

BDYeastmaker酵母转化系统

（三）自备材料

下列试剂自备，无其他特别要求所有的试剂与溶液均储存与室温下。

cDNA第一条链合成

l无菌0.5ml离心管

lPolyA+ortotalRNA

l矿物油

l热循环仪

lDNAmarker（1-kbDNAladder）

l1.2%Agarose/EtBrgel

cDNA的分离

l1.5ml无菌离心管

l带有小架子环型支架

l95%乙醇（-20℃）

l1%氯代二甲苯

诱饵质粒构建

lE.coli感受态细胞。

像DH5αorBDFusion-Blue感受态细胞

lT4DNA连接酶

l10XT4连接buffer

lLB/amp平板

l50mMNaCl

l从E.coli转化子中提取质粒的试剂盒

酵母转化（在无菌容器中