酶工程要点重点Word文件下载.docx

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操作:

a上样：

上样体积不十分严格。

b洗脱:

增加溶液的离子强度 

c梯度洗脱法:

改变溶液的pH

d再生：

用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl处理。

凝胶层析原理：

利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；

小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。

操作：

a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。

将干胶悬浮于5-10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。

b柱的选择:

采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。

c加样:

体积不能过多，不超过凝胶床体积的5％，脱盐时可在10％左右。

d洗脱:

洗脱液与平衡时用的buffer一致。

洗速不可过快，保持恒速。

e胶的保存:

洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。

亲和层析原理:

利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。

简述凝胶电泳的分类及其原理？

琼脂糖凝胶电泳：

一般用于核酸的分离分析。

琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：

可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。

分辨率较高。

简述酶结晶的主要方法和原理？

（1）盐析结晶法：

在适当的温度和ＰＨ值等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度缓慢降低，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程

（２）有机溶剂结晶法：

在接近饱和的酶液中缓慢增加某种有机溶剂，使酶的溶解度缓慢降低，而析出酶晶体的过程

（３）透析平衡结晶法：

将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。

前提：

酶液要达到一定纯度（经过纯化）酶液要浓缩到一定浓度

（４）等电点结晶法：

通缓慢加入浓酶液的ＰＨ值、使之逐渐达到酶的等电点，而析出酶晶体的过程

定点突变技术在酶分子修饰中有何应用？

定义：

指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。

是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。

应用：

新的酶分子结构的设计；

突变基因碱基序列的确定；

突变基因的获得；

新酶的获得。

何谓固定化酶？

经过固定化以后，酶的特性有哪些改变？

固定化酶：

固定在载体上，并在一定空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。

改变有：

稳定性：

固相酶的稳定性比游离酶高，主要表现在：

（1）热稳定性：

固定化酶热稳定性较之天然酶提高。

（2）对蛋白酶水解作用稳定性：

固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。

（3）对变性试剂作用的稳定性：

固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。

（4）保藏稳定性：

固相酶比天然酶保存的时间更长。

最适温度：

（1）固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低

（2）同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同 

最适pH：

酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移影响固定化酶最适PH的因素主要有两个。

（1）载体性质对最适pH影响：

用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH高。

用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。

用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。

（2）产物性质对最适pH影响；

若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH要高。

若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。

若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。

底物特异性：

固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：

作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。

而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。

举例说明固定化酶在工业上的应用？

现已用于工业化生产的固定化酶主要有：

（1）氨基酰化酶：

这是世界上第一种工业化生产的固定化酶。

降低生产成本

（2）葡萄糖异构酶：

这是世界上生产规模最大的一种固定化酶。

常用于连续生产果葡糖浆

（3）天门冬氨酸酶：

用于工业生产。

将延胡索酸转化生产Ｌ－天冬氨酸

（4）青霉素酰化酶：

这是在医药工业上广泛应用的一种固定化酶。

用于制造各种生产半合成青霉素和头孢菌素

什么是固定化细胞？

固定化细胞有何应用？

固定在载体上，并在一定空间范围内进行生命活动的细胞，称为固定化细胞。

固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，故又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。

1、利用固定化微生物细胞生产各种能够分泌到细胞外的产物：

（1）酒精酒类：

（2）氨基酸：

（3）有机酸：

（4）酶和辅酶（5）抗生素（6）固定化微生物细胞还可以用于甾体转化及有机溶剂、维生素、化工产品等的生产。

2、固定化微生物细胞制造微生物传感器：

分为呼吸活性测定型和电极活性测定性两种固定化植物细胞的应用。

（1）制造人工种子

（2）用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物。

3、固定化动物细胞的应用：

主要应用于生产小儿麻痹症疫苗、狂犬病疫苗等

酶反应器的设计主要包括哪些内容？

1、确定酶反应器的类型。

酶反应器的设计，首先要根据酶、底物和产物的性质，按照上一节所述的选择原则，选择并确定反应器的类型。

2、确定反应器的制造材料。

由于酶催化反应具有条件温和的特点，通常都是在常温、常压、pH近乎中性的环境中进行反应，所以酶反应器的设计对制造材料没有什么特别要求，一般采用不锈钢制造反应容器即可。

3、进行热量衡算。

酶催化反应一般在30～70℃的常温条件下进行，所以热量衡算并不复杂。

温度的调节控制也较为简单，通常采用一定温度的热水通过夹套（或列管）加热或冷却方式，进行温度的调节控制，热量衡算是根据热水的温度和使用量计算。

对于某些耐高温的酶，例如高温淀粉酶，可以采用喷射式反应器，热量衡算时，根据所使用的水蒸气热焓和用量进行计算。

4、进行物料衡算。

酶反应动力学参数/底物用量/酶量/反应体积/反应器数量

2.在酶反应器的应用过程中要注意哪些问题？

酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。

在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液PH。

如果局部的pH过高或过低，就会引起酶的失活，或者使底物和产物发生水解反应。

这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。

如果底物和产物在反应器中不够稳定的话，可以采用高浓度的酶，以减少底物和产物在反应器中的停留时间，从而减少损失。

防止微生物污染

酶的分类与命名：

P酶：

主要由蛋白质组成的酶；

R酶：

主要有核糖核酸组成的酶。

酶的分类：

根据酶的化学组成可将酶分为：

1.单纯蛋白酶类：

只含有蛋白质成分；

2.结合蛋白酶类

（全酶）：

含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）

全酶 

= 

酶蛋白+辅助因子

根据酶蛋白结构特点可将酶分为

单体酶：

以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。

寡聚酶：

以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。

多酶复合体：

由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体,它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。

酶合成调节的类型

诱导:

组成酶：

细胞固有的酶类。

诱导酶：

是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

阻遏:

分解代谢物阻遏和反馈阻遏

酶合成的调节机制：

1.酶合成的诱导：

加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。

2.末端产物阻遏：

由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

3.分解代谢物阻遏：

指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。

提高酶产量的措施：

1.添加诱导物：

①酶的作用底物：

如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物。

②酶的反应产物：

如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。

③酶的底物类似物：

如异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）对β-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍2.降低阻遏物浓度：

微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。

为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，如在β-半乳糖苷酶的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。

3.添加表面活性剂（产酶促进剂）：

改变细胞的通透性或对酶分子有一定的稳定作用如在霉菌的发酵生产中添加1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。

酶发酵动力学：

主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物生成速度，基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。

产酶动力学：

主要研究细胞产酶速度以及各种环境对产酶速度的影响规律。

分为宏观酶动力学和微观酶动力学

一般产酶动力学方程可表达为：

。

式中X——细胞浓度（g/L）；

m——细胞比生长速率（h-1）；

a——生长偶联的比产酶系数（IU/g）；

t——时间（h）；

E——酶浓度（IU/L）；

b——非生长偶联的比产酶速率（IU/（g×

h））；

生长偶联型；

部分生长偶联型；

非生长偶联型

细胞破碎：

对于不同的生物体、或同一生物体的不同组织的细胞，由于细胞外层结构不同，所采用的细胞破碎方法和条件也有所不同，必须根据具体情况进行选择。

细胞破碎确认：

1.直接测定破碎前后的细胞数：

破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；

破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。

2.测定导电率：

利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。

3.测定释放的蛋白质量或酶活力：

测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。

.盐析沉淀法（改变离子强度）：

向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：

①盐溶：

低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。

②盐析：

高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。

蛋白质的盐析：

原因：

高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低溶解度而沉淀。

不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。

盐析的影响因素：

①离子强度和种类（介绍盐析常数）②蛋白质浓度：

过稀回收沉淀困难，2.5%-3%最好。

③pH值：

等电点处最易沉淀。

④温度的影响：

稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。

浓盐溶