第三章 基因工程的酶学基础Word文档下载推荐.docx

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大肠杆菌K株和B株都含有各自不同的限制-修饰系统，它们均有三个连续的基因位点控制，其中hsdR编码限制性核酸内切酶，它能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断；

hsdM的编码产物是DNA甲基化酶，催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应；

而hsdS表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。

lK和lB长期分别寄生在大肠杆菌的K株和B株中，宿主细胞内甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点。

当外来DNA入侵时，便遭到宿主限制性内切酶的特异性降解，由于这种降解作用的不完全性，总有极少数入侵的DNA分子幸免于难，它们得以在宿主细胞内复制，并在复制过程中被宿主的甲基化酶修饰。

此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但丧失了在其原来宿主细胞中的存活力，因它们在接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。

大肠杆菌C株不能产生限制性内切酶，因而其它来源的l噬菌体可以感染C株，而在C株中繁殖的l噬菌体则在K株和B株中受到严格的限制作用，细菌正是利用限制修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。

二、限制性内切酶的类型

目前，在细菌中已发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类：

I型限制性内切酶、II类限制性内切酶和III类限制性内切酶。

其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA重组。

I类和III类酶严格地说应该称为限制-修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。

三、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）的性质和功能特点

限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物细胞内，它们是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶（内切酶即在核酸分子链的内部制造切口的酶）。

功能为自我保护作用。

细菌的限制和修饰系统（R-M体系）：

几乎所有的限制性内切酶都和能识别而且甲基化相同DNA位点的甲基化酶共同作用，从而构成限制修饰系统（restriction-modificationsystem）。

R-M系统消化外来DNA，但自身的DNA因被甲基化受到保护。

（1）限制（Restriction）：

限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。

（2）修饰（Modification）；

细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。

细菌细胞内有两种甲基化酶：

①Dam甲基化酶，在GATC腺嘌呤N6位置引入甲基；

②Dcm甲基化酶。

在CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基. 

四、I和III类限制-修饰酶的基本特征

I型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。

I类限制-修饰酶的种类较少，研究较多的是大肠杆菌的EcoK和EcoB，它们均为异源多聚体，其亚基R、M和S分别具有限制性内切酶、甲基化酶和DNA特异性位点识别的活性。

（1）识别位点序列：

未甲基化修饰的特异序列，非对称性。

EcoB：

TGA（N）8TGCT

EcoK：

AAC（N）6GTGC

（2）切割位点；

在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。

（3）作用机理：

需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。

I类酶与其DNA识别位点结合依赖于M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用，后者通过变构作用使酶处于活性状态。

酶分子与识别位点结合之后，根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性，或限制、或修饰、或既不限制也不修饰。

如果识别位点是全甲基化的，则ATP使酶-SAM复合物脱离DNA双链；

如果识别位点是半甲基化的（即只有一条链甲基化），则酶-SAM复合物在ATP的帮助下使非甲基化的DNA链甲基化，同时SAM转变为相应的S-腺苷高半胱氨酸（SAH）；

如果识别位点没有甲基化，ATP可使酶分子再次变构，暴露出限制性内切酶的活性部位，先释放SAM，然后以一种未知的机制在切割位点处将双链DNA切断，同时消耗ATP。

I类酶的切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切割位点的序列并不表现出严格的特异性，两条DNA链上的断裂位点相距70-75个核苷酸，因此切开的DNA分子末端是单链形式。

III类限制-修饰酶由R亚基和MS亚基组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。

该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP，在与识别位点结合之后，修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争。

修饰作用在识别位点内进行，甲基化受体是腺嘌呤碱基，供体仍为SAM。

切割位点位于识别位点一侧的若干碱基对处，但无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同的III类酶具有各自不同的距离，从7至26bp不等，如MboII识别5’AAGA3’序列，其切割位点则是：

5’-GAAGANNNNNNNN↓N-3’

3’-CTTCTNNNNNNN↓NN-5’

产生仅一个碱基突出的3’末端。

五、II类限制性核酸内切酶的基本特征

II类限制性核酸内切酶是H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。

分离的第一个酶是HindⅡ。

该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双链DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组及分子生物学实验中被广泛使用。

1．II类限制性核酸内切酶的命名

目前已分离出400余种II类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有300多种，商品化的约有100种，其中在DNA重组实验中常用的有20多种。

这些酶的统一命名由酶来源的生物体名称缩写构成，具体规则是：

以生物体属名的第一个大写字母和种名的前两个小写字母构成酶的基本名称，如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的一个字母加在基本名称之后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还需用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子。

酶名称的最后部分为罗马数字，表示在该生物体中发现此酶的先后次序，如HindIII则是在Haemophilusinfluenzaed株中发现的第三个酶，而EcoRI则表示其基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上。

2．II类限制性核酸内切酶的识别序列

多数II类酶的识别序列为四、五或六个碱基对，而且具有180°

旋转对称的回文结构。

例如，EcoRI的识别序列为：

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

对称轴位于第三和第四位碱基之间，对于由五对碱基组成的识别序列而言，其对称轴为中间的一对碱基。

一部分II类酶的识别序列中某一或某两位碱基并非严格专一，但都在两种碱基中具有可替代性，这种不专一性并不影响内切酶和甲基化酶的作用位点，只是增加了DNA分子上的酶识别与作用频率。

按照概率计算，四、五或六碱基对的识别序列在DNA上出现的频率分别为1/256（4-4）、1/1,026（4-5）和1/4,096（4-6），若以100种不同的识别序列计算（四、五或六碱基对序列的酶各为20、30和50种），则DNA链上出现一个II类酶识别位点的概率为1/9，即任何一个DNA分子上平均每九对碱基中就会出现一个II类酶切口。

实际上，由于不同生物的DNA碱基含量不同，因此酶识别位点的分布及频率也不同。

大肠杆菌基因组中含有绝对优势的A和T，所以那些富含AT的识别序列（如DraI，TTTAAA；

SspI，AATATT）较为频繁地出现，而链霉菌基因组因其GC含量高达70-80%，故富含GC碱基对的识别序列（如SmaI，CCCGGG；

SstII，CCGCGG）较为常见。

3．II类限制性核酸内切酶的切割方式

绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。

一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，如SstI与SacI、HindIII与HsuI等。

有些酶识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶（Isocandamers）。

还有极少数酶的DNA切割活性依赖于识别序列内部碱基的甲基化作用。

根据被切开的DNA末端性质的不同（不考虑碱基序列），所有的II类酶又可分为5’突出末端酶、3’突出末端酶以及平头末端酶三大类。

除后者外，任何一种II酶产生的两个突出末端在足够低的温度下均可退火互补，因此这种末端称为粘性末端（CohesiveEnds），这是DNA分子重组的基础。

粘性末端（stickyends，cohensiveends）：

含有1至几个核苷酸的单链突出末端。

分两种类型：

5’端凸出（如EcoRI切点）和3’端凸出（如PstI切点）。

粘性末端的意义：

①连接便利。

不同的DNA双链只要粘性末端碱基互补就可以连接；

同一个DNA分子内通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

②5’末端标记。

凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记；

凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。

③补平成平齐末端。

粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。

六、甲基化酶的基本特征

许多II类限制性核酸内切酶都有相应的甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。

这类甲基化酶的命名常在相对应的限制性内切酶名字前面冠以M，例如，EcoRI的甲基化酶M.EcoRI催化SAM上的甲基基团转移到EcoRI识别序列中的第三位腺嘌呤上，经过M.EcoRI处理的DNA分子便不再为EcoRI所降解。

有时一种甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一种酶的切口，如两个串联的TaqI识别位点经M.TaqI甲基化封闭后，出现了一个依赖于甲基化的限制性核酸内切酶DpnI的切割位点。

大肠杆菌细胞内存在着两种DNA甲基化酶，即DNA腺嘌呤甲基化酶Dam（DNAadeninemethylase）和DNA胞嘧啶甲基化酶Dcm（DNAcytosinemethylase），这两类酶本身没有限制性内切酶活性。

Dam酶可在5’GATC3’序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基基团，而Dcm酶则在序列5’CCAGG3’或5’CCTGG3’中的胞嘧啶C5位置上甲基化，使得从大肠杆菌细胞中提取的DNA（包括染色体DNA和质粒DNA）不能被某些限制性内切酶切开，对上述两种甲基化酶的修饰作用敏感的限制性内切酶列在表3-8中。

值得注意的是，有些限制性