保护碱基列表概要Word文档下载推荐.docx
《保护碱基列表概要Word文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《保护碱基列表概要Word文档下载推荐.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
◆ C18柱脱盐：
有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
它不能有效去除比目的片段短的小片段。
实际上，它是一种脱盐的作用。
这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。
对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆ OPC纯化：
OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于95%。
适用于40mer以下引物的纯化。
◆ PAGE纯：
PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链OligoDNA（大于50mer）的纯化特别有效。
◆ HPLC纯化：
HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。
纯度可以大于99%。
主要用于短链和修饰引物的纯化。
该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量？
答：
引物合成引物OD数是这样测定的：
用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。
测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。
需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
4.需要什么级别的引物？
引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用
引物长度要求
纯度级别要求
一般PCR扩增
<
45base
OPC
>
PAGE
诊断PCR扩增
40base
OPC,PAGE
DNA测序
20base左右
亚克隆，点突变等
根据实验要求定
OPC,PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成）
反义核酸
修饰引物
PAGE,HPLC
5.最长可以合成多长的引物？
引物越长，出现问题的概率就越大。
有的公司合成过120base的引物，产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。
6.需要合成多少OD数？
根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1OD就足够了。
但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10OD。
做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。
片段越长,最后全长得率就越低，出错的几率就越大。
超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
7.如何检测引物的纯度？
实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃,2mins）。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色。
8.如何计算引物的浓度？
引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
引物一般配制成10-50pmol/ul。
一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：
V（微升）=OD数*（乘）33*（乘）*（乘）20000/（除）引物的分子量。
引物的分子量可以从合成报告单上获得。
如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：
1OD260=33ug/ml.
9.如何计算引物的Tm值？
引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：
Tm=4℃（G+C）+2℃（A+T）
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm=81.5+16.6xLog10[Na+]+0.41（%GC）–600/size
公式中，Size=引物长度。
Tm的定义：
Tm=Temperatureatwhich50%ofagivenoligonucleotideishybridizedtoitscomplementarystrand.Intheabsenceofdestabilizingagents,likeformamideorurea,Tmwilldependon3majorparameters:
Thesequence:
aGC-richsequencehasahighermeltingtemperature.Thestrandconcentration:
higholigonucleotideconcentrationsfavorhybridformation,whichresultsinahighermeltingtemperature.Thesaltconcentration:
highionicstrengthresultsinahigherTmascationsstabilizetheDNAduplexes.
10.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？
非修饰的引物的MolecularWeight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。
如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量。
或按下列公式计算MW=（NA*WA）+（NC*WC）+（NG*WG）+（NT*WT）+（Nmod*Wmod）＋（Nx*Wx）+（Ni*Wi）+16*Ns–62.
NA,NG,NC,NT,Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA,WC,WG,W,Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2=321.21。
Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量：
Base
MolecularWeight
A
313.21
C
289.18
G
329.21
T
304.19
I
314.2
U
290.17
常规修饰基团分子量
修饰基团
分子量
5’-Biotin
405.45
3’-TAMARA
623.60
5’-（6FAM）
537.46
3’-Dabsyl
498.49
5’-HEX
744.13
3’-（6FAM）
569.46
5’-TET
675.24
3’-AminoModifierC3
153.07
5’-Cy5
533.63
3’-AminoModifierC7
209.18
5’-Cy3
507.59
3’-ThiolModifierC3
154.12
11.如何溶解引物？
干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。
根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTrispH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。
12.如何保存引物？
引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。
引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。
溶解后的引物-20度可以长期保存。
如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。
修饰荧光引物需要避光保存。
13.合成的引物5’端是否有磷酸化
合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。
如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。
14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。
如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。
磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。
SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
15.测序发现引物有突变是怎么回事？
测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物,发生的概率不大，但是肯定也会发生。
用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。
核酸合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。
发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。
引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。
引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。
引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发
升级会员 