分子病理学实验基础.docx

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分子病理学实验基础

分子病理学实验基础

随着分子生物学技术的发展，病理学科在认识疾病，探讨疾病的发生、发展的基础研究方面，从原来的表型分析水平深入到基因分析水平；在疾病的诊断方面，从传统病理形态诊断（组织病理诊断）进展到基因诊断。

分子生物学技术的应用，对研究疾病的病理变化和病变机制在传统病理学基础上有了比较大的进步，能较特异、灵敏而快速地对一些传染病、代谢或内分泌疾病、遗传性疾病等作出诊断，对于肿瘤的诊断、鉴别诊断、评价疗效和估计预后提供了基因分子水平的指标。

第一节DNA的基本知识

核酸由脱氧核糠核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）组成。

在真核生物细胞中，DNA主要存在于细胞核内，线粒体、叶绿体也含有DNA，RNA主要分布在细胞浆内。

核酸的单体单位是核苷酸（有3个特有的成分组成即碱基、戊糖和磷酸）。

参与DNA组成的碱基有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。

1）所有DNA中的A＝T，G＝C，因此A+G＝T+C。

2）DNA碱基组成只有种的特异性，而没有组织和器官的特异性。

DNA由2条反向平行的磷酸核糖骨架并互相绕成双螺旋结构；通过互补的碱基形成氢键，互相紧密地结合在一起形成碱基对。

核酸形成DNA复制是按碱基配对的方式，以一条链为模板形成另一条互补的新链。

这种复制的稳定性和准确性，是DNA具有遗传信息贮存和传递的分子基础。

一、DNA的理化性质

（一）DNA的紫外吸收

DNA在240-290nm的紫外波段具有强烈的吸收值。

最大吸收值在260nm附近；蛋白质在280nm处。

分光光度计测量：

样品必须是均一的，摇匀后再测量结果会准确些。

它是利用分光光度法对物质进行定量定性分析。

核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。

可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。

核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。

每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。

定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。

如：

1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，。

测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。

。

测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。

然而，实验并非一帆风顺。

读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。

灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大

A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。

纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。

如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。

纯样品，A320一般是0。

（二）DNA的沉降特性

溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉。

不同构象的核酸（线形，开环，超螺旋结构）、蛋白质及其他杂质在超离心机的强大引力场中，沉降的速率有很大差异，所以可以用超离心法纯化核酸，或将不同构象的核酸进行分离，也可以测定核酸的沉降常数与分子量。

应用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸时，效果较好。

RNA分离常用蔗糖梯度。

分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。

氯化铯在水中有很大的溶解度。

可以制成浓度很高（8mol／L）的溶液。

应用啡啶溴红—氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开。

这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。

如果应用垂直转头，当转速为65000r/min（BeckmanL-70超离心机），只要6h即可以完成分离工作。

但是如果采用角转头，转速为45000r/min时，则需36h。

离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚。

蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部。

超螺旋DNA沉降较快，开环及线形DNA沉降较慢。

用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA区带部位刺入，收集这一区带的DNA。

用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除CsCl，再用苯酚抽提1~2次，即可用乙醇将DNA沉淀出来。

这样得到的DNA有很高的纯度，可供DNA重组、测定序列及绘制限制酶图谱等。

在少数情况下，需要特别纯的DNA时，可以将此DNA样品再进行一次氯化铯密度梯度超离心分离。

（三）DNA的变性与复性

1、变性

DNA的双链结构称为自然状态，如果这种状态受到破坏，使DNA分子变成为单链结构，以一种紊乱的、随机的线团构型状态存在，这种状态成为DNA变性状态。

从自然状态到变性状态的过程称变性。

引起DNA变性的因素：

温度升高引起热变性，加酸碱引起的变性等。

DNA变性时，一系列理化性质随之发生改变，260nm处吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高，同时其二级结构发生改变，甚至失去生物学活性。

2、复性

在一定的条件下，变性的DNA可以再变为自然状态的DNA，这一过程为复性或退火。

复性作用是在生物学研究中最常用的特性。

DNA-DNA之间或DNA-RNA之间的分子杂交，就是复性的应用。

单链之间的复性，是一个随机的过程，复性后的DNA分子中的2条链，并不是该DNA分子变性的那2条链。

（四）溶解性

DNA易溶于水，不溶于乙醇。

常用的DNA样品往往是溶解在TE缓冲液.

Tris+EDTA缓冲液，TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性,稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂,包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液是保存.

二、DNA的复制

DNA的复制是一个复杂的过程，有许多酶、蛋白质因子在复制中起重要作用。

1、DNA复制的特点DNA复制的起始意味着细胞将要进行下一次的分裂。

2、DNA复制的形式

半保留复制：

在DNA双螺旋结构中，两条多核苷酸的链的碱基互补，在DNA的合成过程中，每一条链均可作为模板合成与原来DNA完全的DNA分子。

每一代的DNA分子的一条链来自亲代，另一条链是新合成的互补链，这种复制的方式称为半保留复制。

全保留复制：

2个子代DNA子代分子中一个分子完全是亲代的分子，另一个分子完全是新合成的分子，这种复制方式称为全保留复制。

散布式复制：

亲代链被分解成很多片段，散布在新的DNA分子中，这种复制方式称为散布式复制。

第二节聚合酶链式反应

聚合酶链反应（PolymreaseChainReaction，简称PCR）技术，是根据生物体内DNA复制的某些特点而设计的在体外对特定DNA序列进行快速、特异和大量扩增的一项新技术。

随着热稳定性TaqDNA聚合酶的研究应用和自动化热循环仪的设计成功，PCR技术的操作程序大大简化，很快被广泛地应用于基因研究的各个顷域，对分子生物学及其相关学科的基础研究和临床诊断等方面起了重大的作用。

一、PCR的基本原理

PCR有2个重要特性：

一是能合成DNA的特定序列；

二是特定序列的大量扩增。

DNA聚合酶能以单链DNA为模板，合成一个与其互补的新链DNA。

将双链DNA加热至接近100℃时，DNA变性，形成单链DNA，此单链DNA可用于合成互补链的模板。

PCR反应中，2条人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。

在适宜的温度下，DNA聚合酶即将dNTP中的脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起始点，沿模板以5’3’方向延仲，合成一条新的互补链。

引物的位置将决定合成的DNA序列。

PCR反应中，双链DNA的高温变性、引物与模板的低温退火和适温下引物延伸3个步骤反复（一定次数）循环。

每一循环中所合成的新链，又都可以作为下一个循环中的模板。

PCR的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，达到迅速大量扩增的目的。

二、反应体系

PCR反应体系中的基本成分应包括模板DNA、引物、4种脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。

（一）模板DNA

PCR的起始材料可以是单链或双链DNA。

如果起始材料是mRNA，则先要通过逆转录获得cDNA，然后cDNA模板进行PCR扩增。

常用的PCR样品DNA／mRNA是从细胞中提取的。

PCR样品不需要纯化，细胞加热变性所释放的DNA可直接用于扩增。

若用DNA粗品做样品，应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白质。

用纯化的DNA做样品，增加了模板的浓度，除去了抑制PCR反应的杂质，可提高PCR扩增的成功率。

提取DNA的基本过程：

1、用蛋白酶K及SDS，在EDTA存在的的条件下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚及胞内的DNA酶失活。

2、用酚／氯仿多次提取，去除蛋白质。

在DNA中若混有少量的RNA，可以用RNA酶去除。

3、最后用乙醇沉淀即可得到纯的DNA。

PCR所需DNA的量极微，不到1微克的基因组DNA序列就足以进行PCR分析。

PCR其至可以从1个DNA分子扩增特定的DNA序列。

DNA分子是非常稳定的，使用PCR技术可以从血清、新鲜组织及石蜡包埋组织等中测出多种病原体、原癌基因和抑癌基因。

PCR检测技术为医学的发展起到了不可估量的作用。

（二）引物

引物是指2段与模板DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。

当2段引物与变性双链DNA的2条单链DNA模板退火后，两引物的5’端即决定了扩增产物的2个5’末端位置。

扩增是从引物的3’延伸的，扩增片段的长度等于引物A加两引物间的序列加引物B。

因此，引物决定了PCR扩增的长度、位置和结果。

选挥高效而特异性强的引物是PCR成败的关键因素。

引物的长度大多住20一30个碱基。

引物设计：

1、寡核苷酸引物用自动DNA合成仪合成。

设计引物的先决条件是与引物结合的靶DNA序列片段必须是清楚的，而与2个结合的2个片段之间的靶DNA序列未必清楚。

2、应尽可能选择碱基随机分布的序列。

尽可能避免具有多聚嘌吟、多聚嘧啶或其他异常序列。

3、引物内部应避免具有明显的二级结构，尤其是发夹结构。

4、人工合成的寡核苷酸引物要用层析法或聚丙烯酰胺电泳（PAGE）法进行纯化。

纯化的引物应在25％乙腈溶液中4℃保存。

5、在PCR反应体系中，引物适宜浓度为0.1-1umol／L。

（三）PCR反应体系

不同实验的反应条件各不相同，反应体系中有关成分包应做相应的调整。

一般反应体系包括以下内容：

1、PCR反应体积一般为50ul或100ul。

2、DNA样品；反应体系还包括KCl、50mmol／L，Tris-HCl、10mmol／L（pH8．4），MgCl2、1.5mmol／L，明胶100ug／m1，每种引物0.25mmol／L。

3、各种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP为0.2mmol／L，TaqDNA聚合酶以及4×dNTPs（dATP、dDTP、dGTP和dTTP）。

4、ATP贮存液的pH应为7.0，4种dNTP的浓度应相同。

（四）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶最初在美国黄石国家公园的一个温泉中发现的一种嗜热菌水生栖热菌的YT菌株中分离出来。

产生TaqDNA聚合酶的水生栖热茵能在70-75℃下生长，具有热稳定性.。

大量实验表明，TaqDNA聚合在高温下不会发生不可逆性变化

TaqDNA聚合酶在950C的半衰期为40min。

TaqDNA聚合酶在PCR中的常用浓度为1-2.5U／100ul反应液。

若酶量过多，会导致非特异性PCR产物增加；相反，酶量过少又会引起PCR产量的不足。

TaqDNA聚合酶的特点：

1、简化PCR操作。

TaqDNA聚合酶能抵抗PCR每次循环开始时双链DNA变性所需的高温处理，不需要在每次循环中添加新鲜酶。

2、提高退火温度，增加PCR特异性。

3、延长到达平台的循环次数，提高PCR产量。

4、能扩增较长的靶DNA序列，而不易形成二级结构。

（五）缓冲液及其它成分

1、一般用10-50mmol/Ltri-HCl缓冲液，200C时PH8.3。

Tris是一种双极离子缓冲液。

2、适宜的Mg2+浓度：

它会影响引物的退火、模板和PCR产物双链的变性温度、PCR产物的特异性、引物的二聚体的形成以及酶的活性和错掺率。

各种dNTP浓度为0.25mmol/L时，Mg2+浓度为1.5mmol/L较为适宜。

螯合剂EDTA和高浓度的带负电荷离子基团（如dNTP的磷酸根）对Mg2+浓度也会产生影响，因为它们可与Mg2+结合而降低Mg2+浓度。

一般用作模板的DNA应溶与10mmol/Ltris-HCl、0.1mmol/LEDTA中。

三、循环参数

PCR扩增是由变性、退火和延伸3个步骤反复循环而实现的。

循环参数是指循环中每一步骤的温度和时间，以及循环次数。

（一）变性温度和时间

模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败常见的原因之一。

典型的变性条件是95℃，30s。

对G、C含量多的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。

DNA的变性仅需要几秒钟。

过度变性也是不必要的，变性温度过高、时间过长，会加快酶的失活。

原则上变性步骤应高温、短时．既要保证变性充分，又要保证聚合酶在整个反应中的活性。

（二）引物迟火

引物退火的温度和时间取决于引物的长度，碱基组成及在反应体系中的浓度。

一般退火温度低于引物的融解温度（Tm）5℃。

G、C含量约为50％，20个碱基的典型寡核苷酸引物，最佳的退火温度为55℃。

在温度较高的条件下退火，可减少引物与模板的错配，提高PCR的特异性。

在典型的PCR反应体系中，引物的浓度为0.2umol/L，在这一引物过量的条件下，退火可在瞬间完成。

（三）引物延伸

引物延伸是DNA合成酶将脱氧核苷酸逐一地加入到引物的3，-0H末端、依据模板序列合成一条互补新链的过程。

引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。

延伸步骤的时间则取决于靶序列长度、浓度和延伸温度。

靶序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间则越长；反之，靶序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短。

一般而言，每1000个碱基的序列，延伸1min便足够了。

（四）平台效应期

平台效应期是指PCR循环的后期，合成产物达到0.3-1pmol水平，由于产物的堆积，使原来以指数的增加的速率变成平坦曲线。

影响因素

1、dNTP或引物等的消耗。

2、反应物（dNTP或酶）的稳定度。

3、最终产物（焦磷酸盐，双链DNA）的阻化作用。

4、非特异产物或引物的二聚体参与竞争作用。

5、在浓度大于10-8M时，特异产物的重退火（延伸率减低，TaqDNA酶消耗，产物链分叉，引物移位）。

6、变性或高产物浓度下产物分离不完全。

7、如循环次数不合理，低浓度错配的非特异产物开始大量扩增，也可以出现反应的平台期。

（五）循环次数

PCR的循环次数一般为25-40个周期。

在PCR各项参数适宜的情况下，PCR的适宜循环次数主要取决于靶DNA的起始浓度。

在设定循环参数时．还应考虑到所用的热循环仪从

一温度转变到另一种温度所需的过渡时间，因此要测定管内的实际温度，要考虑到因热传导造成的管内温度滞后情况。

四、模板的制备

PCR扩增技术对模板的质量和数量要求不高，常规的DNA和RNA制备方法能满足PCR扩增的要求。

（一）血液

取15％50u1EDTA加入Ep管内，再加200u1血液轻轻混匀，12000rpm离心5s，弃上清，将沉淀悬浮于50ul溶液（10mmol／Ltris-HCl、pH7.6,5mmol／LMgCl2，10mmol／LNaCl）中，离心，弃上清，重复3次。

沉淀内加入100ul的双蒸水，轻轻混匀，1000C下作用5min，12000rpm离心5min，取适量进行PCR扩增。

（二）陈旧的精斑

剪碎污染物后放入Ep管内，用碱性TE浸泡30min，加入SDS和蛋白薛K使其终浓度达1％或100ug／ml，50℃消化过夜。

酚、氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。

（三）新鲜组织

取1-2g组织块，剪碎，放人研钵或玻璃匀浆器，加入1-2mlPBS液，充分匀浆处理后，取0.2-0.15m1放人Ep管内再加入1％SDS、蛋白酶K（100ug／ml），消化2h；或加入1％TLS消化5min。

酚、氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。

（四）石蜡包理组织

1、石蜡切片将石蜡包埋组织切5um左右厚的薄片10-15张，放人Ep管内，加入500ul的二甲苯，不时摇匀脱蜡15min，8ooorpm离心10min，重复脱蜡。

然后用75％乙醇脱二甲苯2次，弃上清，沉淀处理同新鲜组织。

2、微量石蜡包埋组织

1）将石蜡包埋组织切5um左右厚的薄片10-15张，放入Ep管内，加入500ulSTE，置于70-80℃水浴10min，期间不时地用滤纸吸取石蜡，反复多次，以后处理同上。

2）将石蜡包埋组织，切5um左右厚薄片10-15张，放人Ep管内，直接进行PCR扩增。

3）采用冻融--裂解法提取结核菌DNA。

石蜡包埋组织切片常规脱蜡后，在经干燥沉淀后的DNA中，加入100ul的蛋白酶K，37C过夜，70~-80℃速冻2-5min后，立即煮沸5min，冰浴5min后8000rpm离心数秒，取上清液适量进行PCR扩增。

（五）mRNA的提取

整个mRNA的提取过程均在冰浴上进行。

细胞按每106（取米粒大小的新鲜组织，剪碎经玻璃匀浆器匀浆后）加100ul变性液，震荡混匀，依次加入醋酸钠、1m1饱和酚和0.2ml氯仿／异戊醇（49：

1）混匀，用力震荡min，置冰浴15min，12000rpm离心15min，取水相层（mRNA）加入3倍体积的无水乙醇，-20℃下作用1h，离心。

干燥沉淀，加水溶解RNA。

五、PCR操作程序

1、取500ulEP管，分别设实验、对照管（阳性，阴性和空白）根据不同实验条件加入各反应成分一定体积。

2、混匀上述成分后，加入模板DNA，1000rpm离心数秒，置94℃作用10min，使模板DNA变性，同时灭活样品中杂酶的活性。

3、同上短时离心数秒、待冷至55℃，加入2ulTaqDNA聚合酶（0.5U）摇匀。

4、加入液体石蜡20-30ul，短时离心使之分层良好。

5、设循环（94℃、1min;55℃、1min；72℃、2min）次数30次。

6、72℃延伸5min。

取出扩增产物检测或置4℃保存。

六、逆转录-PCR（RT-PCR）

RT-PCR是以rnRNA为模板，在逆转录酶的乍用下，合成与模板DNA互补DNA（cDNA），并再以此为模板进行常规PCR的一种的方法。

在检测某些基因表达和RNA病毒方面，具有实用性。

1）cDNA的合成。

取一定量的模板mRNA，在EP管内依次加入KCl、Tris-HCI（PH8.4）、MgCl2、dNTP、RNase抑制剂及逆转录酶，37℃或42℃水浴30-40min。

取出Ep管，95℃灭活5min，以除去逆转录酶对TaqDNA聚合酶活性的抑制。

2）取一定量的cDNA模板进行常规PCR扩增并检测。

七、PCR操作技术的有关问题及注意点

（一）假阳性

在PCR扩增系统中污染了模板序列，造成假阳性，会直接影响结果的判断。

污染机会与PCR循环周期的次数成正相关，标本中的病原微生物、病毒的污染机会和范围是极大的。

许多实验强调设阳性对照和阴性对照。

应注意事项：

1）样品的收集及处理过程应多换1次手套；打开EP管之前，将离心管离心，打开Ep管时要小心外溅。

减少样品操作环节扣次数，样品应在其他成分加人后再加人管内，样品一旦加入管内，立即加盖。

2）做阳性对照时，避免交叉污染，尤在病原体的检测方面，每次操作务必认真做阴性对照和空白对照，排除污染因素。

3）所用EP管、枪头均为一次性使用。

4）每切一份组织都要用二甲苯和无水乙醇充分擦洁切片刀。

5）所用试剂的配制、分装和保存都应在无PCR产物的环境中进行。

试剂应分装保存，避免使用时造成污染。

6）实验结果应与临床联系，时有怀疑的结果要重复实验。

（二）假阴性

造成假阴性的因素主要与PCR整个试剂是否失效有关；DNA／mRNA提取的量及质也是关键。

1）标本存放的时间，尤其是蜡块不仅受时间的影响，而且还受固定剂类型等方面的影响，DNA分子经福尔马林固定后脆性增加，提取过程中的机械损伤更易发生断裂，因此提取的每一步都必须轻柔。

2）Rnase（一种核糖核酸酶Rnase）可降解RNA。

因Nase到处都有，尤其在手上，故操作者要多换一次手套，以防止RNA在制备和反转录过程中降解；提取模板时，要在冰浴上进行。

3）检查酶的活性（所用酌类应保存在-20℃中，用后应立即冻存）。

4）试剂盒中的所有成分必须贮存于-20℃，尽量避免反复冻融试剂盒中的所有成分。

5）PCR每一反应成分是否漏加；加完各成分后要再离心数秒，以使微量的反应成分完全参与PCR循环。

6）检查设置的每个参数是否正确。

八、PCR的质量控制

（一）PCR的室内控制

核心问题就是要避免交叉污染，跟其他检测技术一样，PCR室内控制也是从实验室及实验室操作人员本身着手，所要强调的是，PCR对实验室及实验操作人员的要求更高，稍不注意，就因为交叉而使PCR的测定结果出现假阳性。

1、实验室管理

主要包括2个方面：

一是PCR实验室要有严格的操作规程；二是实验室的特殊设置。

一个完整的PCR实验由标本准备、PCR扩增及扩增后产物的分析检测三个步骤组成。

前二个步骤常有大量的特异NDA存在，是对以后PCR污染的主要来源。

所以以上三个步骤应分开在不同的区域进行，而且所用的实验器具如加样器、吸头、离心管等不能混合使用。

实验室的日常清洁是避免污染的最基本措施。

2、室内控制外源核酸污染的几个方法

（1）紫外线照射。

（2）“巢式引物”的应用

在这种技术中，从第一轮PcR产物中，取出一部分使用位于第一对引物扩增的DNA内的引物再次扩增（称谓“巢式”PCR），因此处于高浓度的第二次扩增后的终产物对以后的使用第一对引物的初次PCR无影响。

在一定情况下，这种方法对减少与PCR后扩增的污染问题极为有用，可有效地控制来自先前扩增的DNA出现的污染，但不能控制在原始标本收集、核酸提取及扩增等由于操作不当而出现的污染。

3．阴、阳性对照

（1）阴性对照的目的在于监测PCR整个过程中可能出现的污染．因此应对PCR的每一个阶段都设置适当的阴性对照。

（2）阳性对照也是监测PCR检验质量的组成部分，可有2种类型：

一是原标本（如血清、痰、分泌物等）阳性对照；另一是已纯化的接近特定的PCR测定敏感性的DNA（亦可为质粒DNA）标本。

原标本阳性对照，与特异纯化或质粒DNA一样，除可以监测PCR扩增产物的有效性外，还可监测待测标本核酸提取过程中核酸的丢失情况，如纯化的DNA经PCR测定阳性，而原标本阳性对照阴性则表明核酸的提取有问题，标本的测定结果不可靠。

4．PCR结果的判读

PCR假阳性结果最可能源于以前扩增的DNA的“遗留物”或标本间的交叉污染。

但还有下面2种可能可导致假阳性结果：

1、类似大小的但非目的产物的扩增；2、在对实验结果的错误判读。

前一种可能性在PCR中颇为常见，尤其是以大的复杂基因作为模扳时。

对实验结果的判读不准确或者缺乏统一的标准，不但易于得到假阳性结果，也可出现假阴性结果。

在PcR实验中，如果靶DNA顺序出现变异，则很可能出现弱阳性或假阴性结果，原则上讲PCR结果的最后判读应是清楚明确的。

（二）PCR的室间质量控制

室间质量控制是临床检验质量控制的一个基本部分，由独立的组织机构进行。

该机构定期地向参加室间质评的各个实验室寄送已知的经编号的标本，实验室应用其日常方法检测这些标本后，将结果汇报给上述组织机构，于是该机构在进行适当的统计学处理