附录基因工程操作中常用的溶液和缓冲液生物学试验教学中心.docx

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附录基因工程操作中常用的溶液和缓冲液生物学试验教学中心

附录一分子生物学实验中常用的溶液和缓冲液

一、酸、碱和盐溶液的配制

盐酸（HCl，分子量36.5，重量百分比36%），1mol/L

按以下顺序混合：

912.5mLH2O；87.5mL浓盐酸。

盐酸（HCl，分子量36.5，重量百分比36%），0.25N/L

按以下顺序混合：

978.4mLH2O；21.6mL浓盐酸。

硫酸（H2SO4，分子量98.07，重量百分比96%），1mol/L

按以下顺序混合：

944.8mLH2O；55.6mL浓硫酸。

硝酸（HNO3，分子量63.02，重量百分比71%），1mol/L

按以下顺序混合：

937.5mLH2O；62.5mL硝酸

冰醋酸（CH3COOH，分子量60.05，重量百分比99.5%），1mol/L

按以下顺序混合：

942.5mLH2O；57.5mL冰醋酸。

乙酸（CH3COOH，分子量60.5，重量百分比36%），1mol/L

按以下顺序混合：

840.5mLH2O；159.5mL乙酸。

甲酸（HCOOH，分子量46.02，重量百分比90%），1mol/L

按以下顺序混合：

957.3mLH2O；42.7mL甲酸。

高氯酸（HClO4，分子量100.5，重量百分比70%），1mol/L

按以下顺序混合：

914.5mLH2O；85.5mL高氯酸。

氢氧化钾（KOH，分子量56.1），1mol/L

56.0gKOH溶解于1LH2O中。

氢氧化钠（NaOH，分子量40.0），1mol/L

将40.0gNaOH溶解于450mLH2O中，补加H2O至1L。

氢氧化钠（NaOH，分子量40.0），10mol/L

将400gNaOH溶于450mL水中，补加H2O至1L。

氨水（NH4OH，分子量35.0，重量百分比25%），1mol/L

按以下顺序混合：

924.9mLH2O；75.1mL氨水。

尿素（CH4N2O，分子量60.06），8mol/L

分批将480.5g尿素溶解在600mL蒸馏水中，加H2O定容只至1L，过滤灭菌。

氯化钠（NaCl，分子量58.5），5mol/L

将292.5gNaCl溶于450mLH2O中，补加H2O至1L。

氯化钾（KCl，分子量74.5），1mol/L

将74.5gKCl溶于450mLH2O中，补加H2O定容至1L。

氯化镁（MgCl2，分子量203.3），1mol/L

将203.3gMgCl2·6H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L，高压灭菌。

硫酸镁（MgSO4，分子量246.5），1mol/L

将246.5gMgSO4·7H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L。

氯化钙（CaCl2，分子量147.0或219.1），1mol/L

将147.0gCaCl2·2H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L，

或将219.1gCaCl2·6H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L。

二、各种常见缓冲液和平衡盐的配制

10%SDS（十二烷基硫酸钠盐）：

称取100gSDS溶解在800mL水中，置68℃水浴中溶解，加数滴浓盐酸调pH到7.2，定容到1000mL，不需要消毒。

禽血DNA提取裂解液：

2mol/L尿素

100mmol/LTris·HCl（pH8.0）

1%SDS

100mmol/LEDTA

现配现用，无需灭菌。

配制方法：

600mL蒸馏水中，顺序加入120.12g尿素，待溶解后加入100mL1mol/LTris（pH8.0），溶解后加入37.2gNa2EDTA·2H2O，溶解后缓缓加入20%SDS50mL，定容至1000mL。

细菌DNA提取裂解液Ⅰ：

25mmol/LTris·HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），50mmol/L葡萄糖，使用前加溶菌酶（2mg/mL）。

细菌DNA提取裂解液Ⅱ（碱-1%SDS）：

1%（W/V）SDS溶解在0.2mol/LNaOH中。

酚（phenol）：

（1）现在有商品酚可直接购买，但是要注意酚的pH值。

（2）酚的纯化和配制（提取核酸用的酚溶液）：

如果购的酚不纯，例如市售酚含有杂质，常呈粉色或淡黄色，需要重蒸二次：

用前从冰箱中取出，在68℃水浴锅中溶解结晶酚，160℃左右蒸馏后，冷却至0℃，加入8-羟基喹啉（100g酚加0.1g8-羟基喹啉），酚变为黄色，8-羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8-羟基喹啉的酚用等体积0.5mol/LTris-Cl（pH8.0）磁力搅拌器搅拌20min，约半小时后两相完全分开，用真空抽液器尽可能吸去上层水相，再加入等体积的0.1mol/LTris（pH8.0）至酚中，搅拌20min，再吸去上层水相，反复数次，至酚相pH值大于7.8，加入0.2%β-巯基乙醇和0.1mol/LTris（pH8.0）分装在棕色瓶中，此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存1个月，纯化和配制酚溶液都要戴手套，以免损伤皮肤。

酚—氯仿—异戊醇：

酚、氯仿和异戊醇按25∶24∶1（V/V）混合而成，加终浓度为0.1%的8-羟基喹啉，上面覆盖一层1cm厚的0.1mol/LTris（pH8.0），分成几份储存于-20℃，超过6个月则废弃。

它用来除去核酸中的蛋白质，异戊醇能消泡沫，有利于水相和有机相分开，氯仿—异戊醇混合液密闭瓶中保存。

Tris-Cl[Tris（三羟甲基氨基甲烷）]，1mol/L

在800mL水中溶解121.1gTris，常温下用浓盐酸调至所需的pH值，常用pH7.4，或pH8.0，混匀后加水定容至1L，高压灭菌。

要获得所需的某一特定pH的0.1mol/LTris·HCl缓冲液的配制，可通过将一定数量的0.1mol/LHCl和100mL0.1mol/LTris溶液混合，如下表附－1所示：

表附－1特定pH的0.1mol/LTris·HCl缓冲液的配制所需的0.1mol/LHCl的毫升数

pH（25℃）

1.1mol/L

HCl（mL）

pH（25℃）

0.1mol/L

HCl（mL）

pH（25℃）

0.1mol/L

HCl（mL）

7.2

89.4

7.8

69.0

8.4

34.4

7.3

86.8

7.9

64.0

8.5

29.4

7.4

84.0

8.0

58.4

8.6

24.8

7.5

80.6

8.1

52.4

8.7

20.6

7.6

77.0

8.2

45.8

8.8

17.0

7.7

73.2

8.3

39.8

8.9

14.0

注意：

Tris缓冲液的pH值随温度变化较大，每1℃可引起大约0.028pH单位的变化。

Tris缓冲液的pH值应调校至待使用温度下的pH值。

因为Tris的pKa值为8.08，因此Tris不应该在大约pH7.2以下和pH9.0以上用作缓冲液。

Tris·HCl，pH6.8,4×：

在40mLH2O中溶解6.05gTris（0.5mol/L），用1mol/LHCl调至pH6.8，补加H2O至整体积100mL，用0.45µm滤膜过滤溶液后于4℃可保存1个月。

Tris•HCl，pH8.8,8×：

在300mLH2O中溶解182gTris（3mol/L），用1mol/LHCl调至pH8.8，补加H2O至整体积500mL，用0.45µm滤膜过滤溶液后于4℃可保存1个月。

Tris•HCl/SDS，pH8.8,4×：

在300mLH2O中溶解91gTris（1.5mol/L），用1mol/LHCl调至pH8.8，补加H2O至总体积500mL，用0.45µm滤膜过滤溶液，再加入2gSDS[0.4%（W/V）]，于4℃可保存1个月。

Tris•HCl/SDS，pH6.8,8×：

在40mLH2O中溶解6.05gTris（0.5mol/L），用1mol/LHCl调至pH6.8，补加H2O至总体积100mL，用0.45µm滤膜过滤溶液，再加入0.4gSDS[0.4%（W/V）]，于4℃可保存1个月。

Tris•HCl/SDS，pH8.45：

在300mLH2O中溶解182gTris（3.0mol/L），用1mol/LHCl调至pH8.45，补加H2O至总体积500mL。

用0.45µm滤膜过滤溶液，再加入1.5gSDS[0.3%（W/V），于4℃可保存1个月。

MOPS（3-吗啉代丙磺酸，分子量209.3）电泳缓冲液，10×：

0.4mol/LMOPS，pH7.0

0.5mol/LNaAc

0.01mol/LEDTA

HEPES（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸），分子量238.3）缓冲盐水（HeBS）：

137mmol/LNaCl

5mmol/LKCl

0.7mmol/LNa2HPO4

6mmol/L葡萄糖

21mmol/LHEPES

调至pH7.05；因为这是一个关键参数，因此应仔细检测。

HEPES缓冲盐水（ＨeBS），２×：

16.4gNaCl（0.283mol/L），0.2gNa2HPO4（1.5mmol/L）

11.9gHEPES酸（0.023mol/L）加H2O至1L

用5mol/LNaOH调至pH7.05（精确的pH值对有效的转染特别重要），过滤除菌。

许多研究者常配制大量的2×HeBS，对溶液的转染效率进行检测后将其等量分装成50mL一份冻存。

从两批2×HeBS溶液获得的转染效率可能有较大的差异。

每一批新鲜配制的溶液都要检查其转染效率。

通过将0.5mL2×HeBS与0.5mL250mmol/LCaCl2溶液混合并旋涡振荡可快速检测2×HeBS溶液的转染效率。

在显微镜下即可很快观测到微小的沉淀形成。

溶液的转染效率必须一直检查，但如果在检查时溶液中不形成沉淀，这可能发生了某种错误。

Hanks平衡盐溶液（HBss）：

5.4mmol/LKCl

0.3mmol/LNa2HPO4

0.4mmol/LKH2PO4

4.2mmol/LNaHCO3

1.3mmol/LCaCl2

0.5mmol/LMgCl2

0.6mmol/LMgSO4

137mmol/LNaCl

5.6mmol/LD-葡萄糖

0.02%（W/V）酚红（可选）

加H2O至1L并调pH至7.4

HBss可从Biofluids或Whittaker公司购买。

不含CaCl2和MgCl2的HBss可配制或购买。

其中可选用的成分通常对实验并无影响，但它们的出现可能对某一过程有损害。

针对单个的方案，决定是否使用这些成分并在“材料”栏中进行了推荐。

TE缓冲液，pH7.4，7.5，或8.0：

10mmol/LTris·HCl，pH7.4，7.5，或8.0

1mmol/LEDTA，pH8.0

TAE（Tris-乙酸）电泳缓冲液：

50×贮存液，pH约8.5：

242gTris碱

57.1mL冰醋酸

37.2gNa2EDTA·2H2O

加H2O至1L

1×工作液：

40mmol/LTris·Ac

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