细胞染色专题之一台盼蓝精.docx
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细胞染色专题之一台盼蓝精
细胞染色专题之一:
台盼蓝
台盼蓝（TrypanBlue,也称Directblue14:
一种死细胞染色用色素
化学名:
3,3'-{[3,3'-Dimethyl（1,1'-biphenyl-4,4'-diyl]bis（azo}bis（5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonicacid,tetrasodiumsalt3,3’-{[3,3’-二甲基-（1,1’-二苯基-4,4’-二基]双（偶氮}-双（5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸,四钠盐分子式:
C34H24N6Na4O14S4
分子量:
960.81
CASNumber:
72-57-1
外观:
黑褐色结晶粉末
摩尔吸光度:
>69,000（在606nm附近
染色原理:
细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的细胞膜,与解体的DNA结合,使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说,台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性,通常认为细胞膜丧失完整性,即可认为细胞已经死亡。
这被称为染料排除测试（dyeexclusion,ErythrosinB（红色、negrosine、eosinY、AO和EB也用于此目的。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞,并可使用细胞计数器进行计数。
溶于水,可以配制成10mg/ml的水溶液,水溶液呈深蓝色。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况,用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟,在显微镜下观察即可。
应用于细胞凋亡:
如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。
如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。
尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的,此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。
储存条件:
常温保存
注意事项:
1.台盼蓝对人体有毒
2.台盼蓝染细胞时,时间不宜过长。
否则,部分活细胞也会着色,会干扰计数。
3.台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说,还比较方便,对贴壁细胞来说,较为繁琐。
因为要消化,有时,96孔板不一定能消化干净。
而且,该法是测定细胞浓度的方法,与细胞悬液的体积有关,加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。
可以说,该法相对准确,可能有一些人为因素的干扰。
细胞染色专题之二:
美蓝
美蓝
英文名:
Methyleneblue,Swissblue
中文名:
亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱性亚甲天蓝等。
分子式:
C16H18ClN3S
分子量:
319.85g/mol
CASNumber:
61-73-4
EINECSNumber:
200-515-2
熔点:
100℃
沸点:
分解
吸收峰:
668nm和609nm。
染色原理:
美蓝是一种无毒性的染料,它的氧化型呈蓝色,还原型无色。
用美蓝对酵母活细胞染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型,而对代谢作用微弱或死细胞,无此还原能力或还原能力极弱,而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
因此,不仅用此法可观察酵母细胞形态,也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
细胞染色专题之三:
吖啶橙
吖啶橙:
N,N,N',N'-tetramethylacridine-3,6-diamine
中文名:
3,6-双（二甲基氨基吖啶
英文名:
AcridineOrange（AO,Euchrysine,3,6-Acridinediamine,WaxolineOrangeA,AcridineOrangeBase,SolventOrange15,RhodulineOrange,RhodulineOrangeN,AcridineOrangeNO,RhodulineOrangeNO,BasicOrange分子式:
C17H19N3
分子量:
265.35g/mol
CASnumber:
10127-02-3
外观:
橙色、红棕色粉末
染色原理:
吖啶橙（AO与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。
AO还可与单链DAN或RNA形成发红色荧光的复合物。
一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出最大波长为526nm（激发502nm的绿色荧光。
一个AO分子与单链DNA或RNA的一个磷酸基相互作用形成聚集或堆叠的结构,此结构发出最大波长为650nm（激发460nm的红色荧光。
因此,AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA或RNA。
它使得用氩激光激发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能。
光谱数据:
与DNA作用时和荧光素相似,激发最大波长502nm,发射最大525nm（绿光。
于RNA作用时,激发最大波长移动到460nm（蓝光,发射最大移动到650nm（红光。
染色程序:
1.用PBS或合适缓冲液制备10-50μMAO溶液。
a
2.将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。
b
3.37℃下孵育细胞10-20分钟。
4.用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次。
5.用带有500nm激发和530nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a由于AO可能具有致癌性,因此操作过程中须格外小心。
b可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基。
储存条件:
避光,冷藏保存
细胞染色专题之四:
碘化丙啶
碘化丙啶
英文名:
Propidiumiodide,Propidiumdiiodide;PI
分子式:
C27H34I2N4
分子量:
668.39
外观:
红棕色粉末
应用:
DNA染色
染色原理:
碘化丙啶（PI是一种溴化乙啶的类似物,它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用,能同时对活细胞和死细胞染色。
光谱性质:
PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。
染色过程:
1.用PBS或适当的缓冲液制备10~50μM的PI溶液。
a
2.将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。
b
3.在37℃培养细胞10-20分钟。
4.用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5.用535nm激发波长,615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。
a由于PI可能具有致癌性,请小心操作。
b也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。
保存条件:
4℃避光保存
对人体有刺激性,请注意适当防护
细胞染色专题之五:
罗丹明123
罗丹明123:
Rhodamine123
分子式:
C21H17ClN2O3
分子量:
381
外观:
橙红色、红棕色固体/粉末
溶解性:
可溶于DMSO
CASNumber:
62669-70-9
染色原理:
Rh123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针,容易被有活性的线粒体摄取,没有细胞毒性。
Rh123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集,发出黄绿色荧光,可用于对许多种细胞进行染色,包括植物细胞和细菌。
由于细胞内ATP的量与Rh123的荧光强度之间有相关性,此化合物被应用于检测细胞内的ATP。
Rh123还用于癌症研究。
光谱性质:
lex\lem（MeOH=505nm\534nm.e（505nm,MeOH=97,000.染色步骤:
1.将0.4mgRh123溶解到1mlDMSO中制备成1mMRh123-DMSO溶液。
2.用载玻片准备细胞。
细胞数目应为5×10e4-5×10e5个/ml。
3.孵育该载玻片,用PBS或Hank’s液洗涤细胞。
4.用培养基稀释1mMRh123溶液以制备1-20μMRh123缓冲液。
5.将Rh123缓冲液a加入载玻片并在37℃下孵育30分钟至1小时。
6.去除Rh123缓冲液并用培养基洗涤细胞。
b
7.用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a加入细胞前将Rh123缓冲液放在37℃下孵育。
b洗涤细胞后为了固定,加入10%福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟,接着用PBS洗涤。
储存条件:
避光冷藏保存
细胞染色专题之六:
溴乙锭
溴乙锭:
Ethidiumbromide
化学名:
溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶
英文名:
2,7-Diamino-10-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromide,2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridiniumbromide,3,8-Diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiniumbromide,3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromide,Homidiumbromide,EB,EtBr
别名:
胡溴胺;溴乙胺菲啶;溴乙菲啶
分子式:
C21H20BrN3
分子量:
394.31g/mol
CASnumber:
1239-45-8
熔点:
260-262℃（fromwiki
性质:
从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体,熔点238~240℃;20℃时溶于20份水和750份氯仿。
染色原理:
EB不能穿过活细胞的细胞膜,然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞核DNA染色。
EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团,这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致染料与DNA结合并呈现荧光,由于EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率,所以当电泳凝胶中含有游离EB时,也可检测出少量DNA。
它是一种高灵敏的荧光试剂,也是一种重要的荧光染料,常用于检测DNA和RNA。
EB与DNA结合后抑制DNA的复制和转录。
光谱性质:
EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518nm和605nm。
染色过程:
1.用PBS或合适的缓冲液制备10-50μMEB溶液。
a
2.将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中。
b
3.37℃下孵育细胞10-20分钟。
4.用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5.用带有515nm激发波长和600nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a由于EB可能有致癌性,操作时须十分小心。
b可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。
储存条件:
避光,冷冻保存
细胞染色专题之七:
曙红Y
曙红:
EosinY
中文名:
水溶伊红;四溴荧光黄;朝红;四溴荧光素钠;曙红钠盐;曙红,水溶性;黄光曙红
英文名:
EosineYellowish,Bromoeosine,Tetrabromofluorescein
C.I.name:
Acidred87
分子式:
C20H6O5Br4Na2
分子量:
691.9
性质:
以AgNO3滴定Br-,I-,SCN-等时用作吸附指示剂。
CASNumber:
17372-87-1
MDLnumber:
MFCD00005040
ColourIndexNumber:
45380
光谱性质:
最大吸收524.8nm;最大激发490nm
染色原理:
EosinY为酸性染料,将胞质染成粉红色（嗜酸性,是组织和细胞化学常用染色试剂之一,常与苏木精（hematoxylin,为碱性染料,将核染成紫蓝色（嗜碱性联合使用（HE染色法。
在免疫组织化学实验中,常作为衬染试剂以便于组织和细胞结构的观察。
存储条件:
室温避光保存
细胞染色专题之八:
苏木精
苏木精Hematoxylin
中文名:
苏木色精,苏木色素,苏木精,苏木素,洋苏木素
英文名:
Hematoxyli
7,11b-Dihydrobenzindeno[1,2-d]pyran-3,4,6a,9,10（6H-pentol,NaturalBlack
分子式:
C16H14O6
分子量:
302.28
性质:
无色棱形晶体,遇光变红;熔点100-120°C;难溶于冷水和乙醚,易溶于热水和热乙醇,溶于碱、氨和硼砂的溶液。
含有3分子结晶水,在100~120℃溶于本身的结晶水中。
在水溶液中,特别是在碱溶液中易被空气氧化成红棕色的氧化苏木精。
C.I.name:
Naturalblack
C.I.number:
75290
CASnumber:
517-28-2
EINECSnumber:
208-237-3
BeilsteinRegistryNumber:
91400
EG/ECNumber:
2082373
MDLnumber:
MFCD00078111
染色原理:
苏木精是染细胞核的优良材料,他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。
分化时组织所染的颜色因处理的情况而异,用酸性溶液（如盐酸—酒精分化后呈红色,水洗后仍恢复青蓝色,用碱性溶液（如氨水分化后呈蓝色,水洗后呈蓝黑色。
用途:
一种天然媒介染料。
用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花,用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。
与重铬盐、铁盐、亚铁盐、铝盐和锡盐等一起可制
成各种色淀。
在分析化学中用于比色分析、显微镜分析,并用作pH值指示剂,变色范围5.0~6.0,由黄色变紫色。
作为天然色素,多用于食品工业、日化工业、皮革及织物染色等,病理实验中可作为细胞组织切片的染色剂.苏木水提物最早被发现有抗癌作用,随后的研究证明了其抗癌活性物质就是苏木精
细胞染色专题之九:
孔雀绿
孔雀绿（MalachiteGreen
中文名:
孔雀绿,孔雀石绿,碱性绿,盐基品绿
英文名:
Malachitegreen,anilinegreen,basicgreen4,diamondgreenB,victoriagreenB,4-[（4-dimethylaminophenyl-phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-aniline
分子式:
C23H25ClN2（chloride
分子量:
364.911g/mol（chloride
性质:
孔雀绿是有毒的三苯甲烷类化学物,既是染料,也是杀菌剂,可致癌。
孔雀石绿一般有二种。
第一种是天然的矿石,为水合碱式碳酸铜[Cu（OH2CO3或2CUOCO2H2O],呈翠绿或草绿色的块石,含71.9%CuO、19.9%CO2、比重3.9-4.03、能溶于酸类。
主要用于铜的提炼和供作颜料,但并不用于水产养殖业。
第二种是孔雀石绿染料（MalachiteGreenDyestuff,又有AnillneGreen、ChinaGreen、VictorlaGreen等多个名称,是人工合成的有机化合物。
它的生产是由1分子（mol的苯甲醛Benzaldehyde和2分子的二甲苯胺Dimethylaniline在浓盐酸混和下,加热缩合成隐色素碱Leucobase,在酸性下加过氧化铅使其氧化,并在（酸?
碱?
性液中沉淀出色素碱,它是属于三苯基甲烷型的绿色染料TryphenylMethaneDyestuffs。
绿色闪光结晶,溶于水、酒精显蓝绿色;遇硫酸呈黄色,稀释后呈暗橙色;水溶液加氢氧化钠形成微带绿光的白色沉淀。
PH值在0.13~2.0变色为黄~浅蓝~绿,PH值在11.5~13.2变色为蓝绿~无色。
CASnumber:
569-64-2
光谱性质:
最大吸收616.5nm
染色原理:
孔雀石绿可用作生物染色剂,把细胞或细胞组织染成蓝绿色,方便在显微镜下研究。
孔雀石绿也用作丝绸、皮革和纸张的染料。
虽然称作孔雀石绿,但其实它不含有孔雀石的成份,只是两者颜色相似而已。
用于芽孢染色的步骤:
取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片,风干固定后,在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液,染色10分钟后,用水冲洗,再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟,水洗,风干后镜检。
芽孢被染成绿色,营养体呈红色。
细胞染色专题之十:
DAPI
DAPI
中文名:
4,6-联脒-2-苯基吲哚（?
英文名:
4',6-diamidino-2-phenylindole,2-（4-amidinophenyl-1H-indole-6-carboxamidine,DAPIdihydrochloride
分子式:
C16H15N5
分子量:
277.324
CASnumber:
28718-90-3
光谱性质:
与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358nm/461nm;与RNA结合时,最大发射移动到400nm左右。
染色原理:
DAPI为一种荧光染料,可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用,可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光,和EB相比,对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。
显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞,荧光显微镜观察细胞标记的效率高（几乎为100%,且对活细胞无毒副作用。
DAPI染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。
DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。
细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟,在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。
a、正常的烟草细胞核:
核形完整,染色质均匀。
b、染色质固缩,向外周聚集,形成周边化。
c、染色质进一步固缩,形成很多颗粒物质。
d、细胞核破裂形成碎片,核解体。
染色步骤:
在细胞移植前,将DAPI以一定的浓度加入培养基中,与细胞共同孵育过夜,用PBS缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI,在用酶消化后离心收集细胞,加入DMEM培养基制成细胞悬液以备用。
存储条件:
-20℃避光保存（?
4°C?
注意事项:
1、DAPI强烈致癌,操作时要戴上手套。
2、贮存液用70%酒精配制,浓度100µg/ml,可用黑纸包住,长期冻存。
使用液按1:
1000用PBS稀释,最终浓度100ng/ml。
3、DAPI是非常优秀的DNA染料,固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。
细胞染色专题之十一:
结晶紫
结晶紫（crystalviolet
中文名:
（结晶紫,氯化甲基玫瑰苯胺,结晶紫,龙胆紫,甲基青莲,碱性紫,甲紫,其溶液俗称“紫药水”
英文名:
crystalviolet,Methylviolet2B,Methylviolet,methylrosanilinechloride,GentianViolet,BasicViolet,
分子式:
C24H28N3Cl
分子量:
393.958g/mol（6B
性质:
绿色具金属光泽晶体或深绿色结晶性粉末。
易溶于醇,溶于氯仿,可溶于水,溶液呈紫色,不溶于醚。
自水中结晶者有九分子结晶水。
熔点137°C（279°F,215℃分解。
浓酸中呈黄色,当pH值增大时其颜色变化是黄→绿→蓝→紫。
与Sn4+、Tl3+、Au3+和Sb3+的卤络阴离子及MoO、ReO等形成缔合物,能被苯、甲苯等有机溶剂萃取。
在溴蒸气存在下,试剂与类脂质产生蓝色物质（黄色背景。
用途:
用作酸碱指示剂,pH值0.15（黄~0.32（绿,pH值1.0（绿~1.5（蓝,pH值2.0（蓝~3.0（紫。
用于非水滴定。
还用于光度法测定硼、锑、铼、铊、钽、金、钨、锌、镉、汞等的离子缔合剂。
并用作生物染色剂及用作薄层色谱法测定脂质的试剂。
医用杀菌防腐药。
CASnumber:
8004-87-3
C.I.number:
42535
染色原理:
常用于革兰氏染色法（Gramstain不仅能观察到细菌的形态,而且还可将所有细菌区分为两大类:
染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示步骤:
革兰氏染色法不仅用来观察细菌的形态,而且它还是细菌鉴定的重要方法,它可将全部细菌区分别革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。
革兰氏染色法的步骤为:
涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察。
涂片与单染色法相同。
固定与单染色法相同。
结晶紫染色染色1分钟,然后水洗并用吸水纸吸干。
碘液媒染染色1分钟,然后水洗并吸干。
酒精脱色用95%酒精脱色,直到酒精不出现紫色时即停止（大约半分钟,然后立即水洗,并吸干。
番红复染染色3分钟左右,然后水洗并吸干。
镜检在显微镜油镜头下观察,菌体显蓝紫色的为革兰氏阳性菌;菌体显红色的为革兰氏阴性菌。
注意:
不应当与另外两种染色剂甲基蓝（methylblue以及亚甲基蓝（methyleneblue相混淆。
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