植物细胞工程课件资料.docx
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植物细胞工程课件资料
绪论
第一节细胞工程在生物技术领域中的地位
一、生物技术(biotechnology):
利用生物学过程解决人类生存和发展所面临的问题。
内涵:
运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质,培育出人们需要的生物新品种;工业规模地利用现有生物体系,制备生物产品;模拟生物体系,以生物化学工程代替化学工程,制备工业产品;发展相应的科学理论与工程技术。
包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化过程。
二、细胞工程概念及范畴
细胞工程(cellengineering):
应用细胞生物学和分子生物学方法,借助工程学的实验方法或技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。
广义:
所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。
狭义:
细胞融合和细胞培养技术。
三、与其它相关课程关系
1、理论基础:
细胞生物学、分子生物学、生物化学。
2、细胞工程提供了新的实验体系
细胞融合、核移植技术(将一个细胞的细胞核转移到另一个去核细胞中的操作。
常用于研究核质关系和克隆动物):
定向改造生物遗传性状
植物离体培养技术优势:
人工控制、缩短研究周期
3、与其它技术相结合
四、细胞工程在现代生物技术中的地位及实践意义
1、改善农业生产技术
利用有限的农业资源养活更多的人口
2、保护自然资源,维护生态平衡
生物农药是指利用生物活体(真菌,细菌,昆虫病毒,转基因生物,天敌等)或其代谢产物(信息素,生长素,萘乙酸,2,4-D等)针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。
3、生物医药开发
第二节植物细胞工程发展
植物细胞工程:
以植物组织细胞为基本单位,在离体条件下进行培养、繁殖或人为地精细操作,使细胞的某些生物学特性按人们意愿发生改变,从而改良品种或创造新物种,或加速繁殖植物个体,或获得有用物质的过程。
利用离体培养细胞进行遗传操作,实现植物品种改良的生物技术。
安全的,绿色的技术:
不涉及重组DNA和有害外源基因的导入。
1、探索阶段
细胞学说:
1839,Schwann“如果具有与有机体内一样的条件,每个细胞应该可以独立生活和发展”
细胞全能性学说:
1902,Haberlandt《植物细胞离体培养实验》
2、培养技术建立阶段
一是培养基模式二是激素调控模式
Ø幼胚培养和胚胎拯救(embryorescue):
最先应用的植物细胞工程技术
ØB族维生素的应用:
White等
Ø腺嘌呤的发现:
Skoog和Tsui(崔澂)
Ø激动素的发现:
Miller
Ø单个胡萝卜细胞形成体细胞胚:
1958,Steward
3、应用研究阶段
茎尖培养与脱病毒快速繁殖
中国罗士韦最早研究茎尖培养
MorelandMartin将茎尖培养应用于脱毒
形成最早的植物细胞工程产业
单倍体技术,三倍体育种,原生质体培养和体细胞杂交
中国学者均做出重要贡献
应用研究阶段
•体细胞无性系变异:
高蛋白小麦、高赖氨酸玉米、耐盐小麦等
•植物细胞大量培养生产有用的次生代谢产物:
紫草素、紫杉醇等
•离体受精与合子培养
二、我国植物细胞工程的研究进展
花药培养和单倍体育种:
朱至清N6培养基
植物脱毒和快繁技术原生质体培养技术人工种子次生代谢物生产
第三节植物细胞工程技术类别及应用
一、类别:
不同培养层次、不同工程技术策略
二、应用
1、育种上应用2、种苗脱毒与快繁3、次生代谢物生产
植物细胞工程技术在育种上的应用
•1、快速获得特殊倍性材料:
单倍体、三倍体2、克服远缘杂交不亲和性3、克服杂种胚早期夭折4、导入外源基因5、突变体筛选6、种质资源保存
Ø细胞学说:
细胞是生物结构、功能和发育的基本单位
胡克施莱登施旺
Ø染色体及分裂行为的发现:
strassburgerHertwigFlemmingBoveri
Ø孟德尔遗传定律
Ø细胞全能性学说:
Haberlandt,1902
细胞有可能在离体培养条件下分裂分化,形成胚胎和植株
第一节胚性细胞—植物的干细胞
胚性细胞或分化程度不高的细胞才具备发育为胚胎和植株的全能性
早期胚胎细胞顶端分生细胞成熟组织中遗留的胚性细胞(能够产生不定胚或不定芽的体细胞)
茎端和根端分生细胞
第二节从分化细胞到胚性细胞
植物的胚胎干细胞:
茎端分生细胞、形成层分生细胞和薄壁细胞
组织干细胞:
分化程度高的一些细胞
脱分化(dedifferentiation):
分化细胞转变为分生状态,形成胚性细胞团或愈伤组织的现象。
脱分化条件:
创伤和外源激素
第一章引子细胞全能性学说
第一节细胞全能性及其表达
细胞工程的核心是在培养条件下调控细胞全能性表达
一、细胞全能性
1839,Schwann:
低等植物的任何细胞均能从植物体分离并继续生长。
细胞全能性(celltotipotency):
一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力。
动植物细胞都有全能性。
细胞全能性学说:
作为高等植物器官和组织基本单位的细胞,有可能在离体培养条件下实现分裂和分化,乃至形成胚胎和植株。
不同细胞全能性差异
理论上,任何一个生活细胞都有全能性,但要首先回复到分生状态或胚性细胞状态。
不同细胞回复能力不同。
合子及早期胚胎细胞均为胚性细胞。
植物胚胎干细胞:
植物顶端分生组织细胞具有较强表达全能性能力。
完全失去分裂能力的细胞,如细胞核开始解体的筛管和木质部部分不能回复全能性。
***三类植物细胞:
•茎尖、根尖、形成层细胞—周期细胞
•导管、筛管、气孔保卫细胞等特化细胞,终端分化细胞。
•表皮细胞及各种薄壁细胞。
受外界刺激后可重新启动分裂,称为G0细胞。
“生理脱离”效应:
invivo,细胞全能性不表达;invitro,可再生。
外在调控:
细胞的脱分化和再分化。
细胞或组织的离体培养技术就是细胞脱分化和再分化的控制过程。
全能性表达的基本前提:
与母体的分离、激素的调控
二、培养条件下的细胞脱分化
Ø脱分化是细胞全能性表达的前提
Ø再分化是细胞全能性表达的最终体现
脱分化(dedifferentiation):
培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生
细胞状态的过程。
***细胞脱分化过程中的生理活动与细胞结构变化:
细胞质显著变浓,大液泡消失
核体积增加并逐渐移位至细胞中央
细胞器增加
其中细胞脱分化的重要特征:
液泡蛋白体的出现,质体转变为原质体。
细胞开始脱分化的标志:
蛋白体的出现,同时细胞质密度增加。
***细胞脱分化的3个阶段
1、启动阶段:
细胞质增生,开始向细胞中央伸出细胞质丝,液泡蛋白体出现
2、演变阶段:
细胞核向中央移动,质体转变为原质体
3、脱分化终结期:
回复到分生细胞状态,细胞分裂即将开始。
***激素的作用
•激素是离体培养的必须条件,与植物激素相关的基因表达是启动细胞脱分化的关键。
•激素并不直接作用于DNA而导致特定基因的激活,而是需要受体蛋白及其它信号转导过程的参与。
•生长素感应:
植物细胞感受生长素的信号时通过生长素受体和生长素分子相结合,使生长素受体被活化来完成。
***细胞分裂与愈伤组织形成
•多数情况下,细胞脱分化后进入细胞分裂的结果是形成愈伤组织,但不是脱分化必然形成愈伤组织。
•愈伤组织内细胞并不均一。
•脱分化是细胞生理状态的改变,形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。
三、细胞分化
•细胞分化(differentiation):
导致细胞形成不同结构,引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
•再分化(redifferentiation):
离体条件下,细胞脱分化后,无序生长的细胞及其愈伤组织重新进入有序生长再生为个体的过程。
再分化过程事实是基因选择性表达与修饰的人工调控过程。
•管家基因(housekeepinggene):
维持细胞最低生命活动的基因,如组蛋白基因
•奢侈基因(luxurygene):
与细胞行使特殊功能有关的基因,常在一定条件下大量表达。
•细胞分化从基因调控水平上来说即是奢侈基因选择性表达的结果。
***极性与细胞分化:
•极性(polarity):
植物细胞分化中一个基本现象。
•细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。
•极性生长的重要原因:
细胞内不同方向Ca+梯度分布。
***激素在细胞分化中的作用:
•生长素能刺激木质部的发生。
•生长素和细胞分裂素对于细胞生长和分化具有协同作用,不同的量比配合对细胞分化有重要的调节作用。
•内源激素水平的差异使得对外源激素的反应不同。
•先生长素后分裂素,利于细胞分裂;反之,利于分化。
***植物细胞离体培养再生两条途径:
1、器官发生(organogenesis)
2、体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis)
第二节器官发生
植物的离体器官发生:
培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根(adventitiousroots)、不定芽(adventitiousshoots)等器官的过程。
一、离体培养中器官发生的方式
•1、先芽后根,较为普遍。
2、先根后芽。
•3、愈伤组织的不同部位形成芽和根,再通过维管组织的联系形成完整植株。
二、愈伤组织离体再分化器官的3个生长阶段
1、外植体经诱导形成愈伤组织。
愈伤组织calluscalli一团无序生长的细胞
2、“生长中心”形成:
拟分生组织,细胞小,细胞质稠密,蛋白质合成丰富,液泡逐渐消失。
由无序到有序。
3、器官原基及器官形成。
***不经过愈伤组织形成器官原基的2种情况
1、外植体中已存在器官原基,如茎尖、根尖分生组织培养
2、外植体某些部位细胞,重新分裂后直接形成分生细胞团,形成器官原基。
三、起始材料对器官分化的影响
1、母体植株的遗传基础:
被子植物比裸子植物容易
2、外植体类型:
生理状态年轻,来源于生长活跃或生长潜力大的组织器官的细胞更易培养。
四、激素对器官分化的调控
•IAA与KT比例高时利于根的形成,低时利于芽的形成
•植物多肽PSK可极大加强基本激素的作用效果。
***激素的活化形式和钝化形式
•细胞分裂素自由碱基形式是活性形式,核苷形式为钝化形式。
•生长素,游离态具有诱导和调控作用,与氨基酸等的复合体形式是钝化形式。
***光照对器官发生的影响
•诱导中暗培养或弱的散射光利于愈伤组织形成。
•分化阶段一般每天光照14~16h。
•连续光照利于维管束形成
•昼夜光照周期利于极性建立和形态发生。
第三节体细胞胚发生
体细胞胚somaticembryo(胚状体embryoid):
离体培养下没有经过受精过程,但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。
1、离体培养
2、起源于非合子细胞
3、有胚胎发育过程,不同于器官发生途径
一、体细胞胚的形成
1、从外植体上直接发生
2、经过愈伤组织:
诱导形成愈伤组织;胚性化;体细胞胚形成。
高浓度2,4-D可诱导愈伤组织产生;转到低浓度使胚性化。
3、细胞悬浮培养的体细胞胚发生
胚性细胞团:
成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞。
***好的细胞系的获得途径
1、液体培养基中建立细胞悬浮系
2、固体培养基诱导胚性愈伤组织,再悬浮培养。
***体细胞胚的结构与发育特点
•体细胞胚发育成再生植株有两个特点:
1、双极性(doublepolarity)2、生理隔离:
体细胞形成后与母体的维管束系统联系较少。
***体细胞胚与合子胚的不同
•合子胚发育初期有明显的胚柄,体细胞胚只有类似胚柄的结构。
•子叶不规范·体积小·干物质含量低·含水量高·没有休眠
***影响体细胞胚发生的因素
1、外源激素的调控
2,4-D应用最为广泛。
一般单子叶使用浓度高于双子叶。
一般形成球形胚后除去生长素利于胚的继续发育。
分裂素对于维持根和茎分生组织的生长发育有重要作用。
常用BA。
体细胞胚诱导中,分裂素浓度一般低于生长素。
2、培养基及条件的影响
体细胞胚发生要求培养基含有一定浓度的还原态氮。
球形胚形成后,降低无机盐浓度可显著促进体细胞胚的进一步发育。
3、不同基因型间差异
自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物易获得体细胞胚。
四、体细胞胚发生的生化基础
1、内源生长素的变化
外源通过内源起作用。
外源2,4-D效果好:
细胞内高浓度的游离形式,对内源激素没有反馈抑制。
2、特异蛋白质
胚性愈伤组织的水溶性和盐溶性蛋白高,非胚性的醇溶性蛋白高。
第二章离体培养下的遗传与变异
体细胞无性系变异(Somaclonalvariation):
经过组织培养循环出现的再生植株变异。
体细胞无性系变异是普遍现象,组织培养是诱导的主要原因。
1、体细胞再生植株的变异2、花粉植株的无性系变异
***随机性变异和人为创造变异
随机性变异:
体细胞培养过程中产生的
人为创造变异:
体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合具有目的性和方向性
物理诱变(紫外线、X射线等)和化学诱变(DES、EMS等)
第一节离体培养中的遗传与变异特点
嵌合体(mosaic):
同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞
外遗传变异:
不涉及基因结构的变化,只是在基因表达水平上的差异,是细胞内原有遗传潜力在离体培养中诱导表达的结果。
如最常见的生长素自养型变异。
生理适应性变异:
在某种外界条件存在时才表现出变异。
***体细胞无性系变异的特点
1、体细胞无性系变异是组培中较普遍现象2、体细胞无性系变异可遗传3、体细胞无性系变异频率显著高于自然突变4、体细胞无性系变异与外植体来源及培养时间有关
***影响无性系变异频率的因素
1、外植体的来源
不同物种、不同品种、不同器官的外植体对无性系变异率都有影响。
分化水平高的组织产生的无性系比分生组织产生的更易变异。
2、外源激素:
激素对多倍体的诱导在各种植物中有所不同
3、继代培养时间:
愈伤培养时间延长会使培养细胞中染色体数目变异范围增加
4、再生植株方式:
体细胞胚胎发生形成的植株也存在无性系变异
5、外植体细胞中预先存在的变异
***其它一些规律
1、二倍体细胞较单倍体细胞稳定2、变异率随树龄增加而增高3、高浓度生长素促进二倍体细胞分裂,低浓度促进多倍体细胞分裂4、悬浮培养的细胞易产生变异5、原生质体细胞培养更易产生变异6、性细胞再生植株更易变异
***获得较高频率的体细胞无性系变异
以分化程度高的组织或细胞为外植体,在一定植物激素浓度下诱导愈伤,并经较长时间的继代培养,然后诱导分化再生植株,有可能得到较高频率的体细胞无性系变异。
第二节体细胞变异的细胞遗传学基础
1、染色体数目和结构变异
非整倍体染色体断裂、缺失、易位、基因重复和突变
植物组织和细胞进入离体培养环境后,细胞分裂的不规则性显著增加,导致染色体和分子水平的变异。
最常见是染色体数目变化。
***染色体结构变异
结构变异根本原因在于染色体断裂,断裂会造成染色体缺失及重接后重复、倒位、易位。
在农作物和近缘属的远缘杂种中异源染色体之间的易位系利用价值最大,因为可以引入有用的外源基因。
离体培养细胞染色体易于断裂原因:
细胞离体培养时分裂周期缩短,分裂速度加快,异染色质复制落后于真染色质,形成染色体桥,造成染色体断裂。
2、离体培养细胞异常有丝分裂类型
培养细胞染色体数目变化由异常有丝分裂产生,异常有丝分裂有以下类型:
1、有丝分裂失败或进行无丝分裂2、核内有丝分裂(endomitosis):
染色体复制而细胞不分裂
3、核内再复制(endoreduplication):
DNA复制而染色体不复制4、有丝分裂时形成多极纺锤体
第三节体细胞变异的分子遗传学基础1
1、DNA总量的变异(扩增与丢失):
组培中DNA重复序列有显著的选择性扩增
2、核基因突变(碱基突变):
点突变是引起无性系变异的原因之一
诱发突变和无性系变异中均存在大量单基因突变,但诱发突变多是隐性基因突变,而无性系变异中,显性变异频率也很高。
无性系变异经常出现一个或少数基因的突变,即所谓“微变异”,特别适合于不改变品种基本特性而改变个别特性,这是杂交育种,甚至诱变育种都做不到的。
3、细胞质基因突变
4、转座因子(transposibleelements)的活化
转座子根据转座机理可分两类,转座子(transposons)和逆转座子(retrotransposons)。
两类转座子在组培中能被激活,发生转座和插入,引起变异。
转座子活化可解释无性系变异的一些特点:
①转座子活化可造成基因表达的广泛变化,因此无性系变异频率才如此之高
②转座子具有使不活动的结构基因活化特点,因此会有显性基因
③转座子还可使多拷贝基因中那些不表达的拷贝活化,提高基因表达的强度,即基因放大。
5、DNA甲基化
通过DNA甲基化和去甲基化调控基因的表达与关闭,适应环境对生物体的压力。
***无性系变异在育种上的应用
1、在田间从再生植株中选择有用的细胞突变体
体细胞无性系变异适于对现有品种进行有限的修饰与改良
2、利用选择压选择有用细胞突变体
在愈伤培养阶段向培养基加入选择压,选择有用的抗性细胞系,经再生获得抗性突变植株。
3、利用体细胞无性系变异获得易位系:
①利用远缘杂种体细胞培养物的无性系变异获得易位系
②利用远缘杂种花药培养的无性变异系获得易位系
***利用选择压选择有用细胞突变体
1、对氨基酸和氨基酸类似物抗性的选择
有可能得到必需氨基酸含量高的细胞突变体:
氨基酸类似物在氨基酸生物合成中可起假反馈抑制剂作用,或被组入蛋白使酶功能失活。
加入相应的天然氨基酸可解除对生长的抑制,可能由于反馈敏感性的改变而导致天然氨基酸过量生产,过量生产的氨基酸可被排入培养基中。
2、抗病细胞突变体的筛选3、抗除草剂细胞突变体的筛选4、抗逆细胞突变体的筛选:
抗盐细胞系及植株,聚乙二醇作为筛选剂获得耐旱植株,低温作为筛选剂获得耐旱植株,重金属离子为筛选剂得到多种突变体5、单倍体细胞突变体的筛选:
利用单倍体培养细胞的无性系变异筛选抗性突变细胞株具有高效和容易稳定两大优越性:
隐性突变基因可以表达,大大提高选出抗性细胞株的机率;显著加快了突变体的稳定和纯合过程。
第三章植物细胞培养技术原理
实验室及设备
★培养基制备室:
烘箱冰箱天平灭菌锅
★无菌操作室:
超净工作台(生物安全柜)
★培养室:
光照培养室暗培养室摇床
★显微工作室:
倒置显微镜
***器皿的选择与清洗
清洗:
自来水洗,烘干泡酸自来水洗去离子水洗三蒸水洗烘干
新瓶子均按该程序清洗,培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。
酸液(洗液):
浓硫酸加重铬酸钾
***培养基母液的配制1
基本培养基:
不含激素的培养基
母液:
浓缩液
※大量元素母液:
通常配成10×浓缩液,配1L培养基时加100mL
注意:
配制时加一个溶解一个,最后加钙
※微量元素母液:
通常配成1000×浓缩液,配1L培养基时加1mL
※铁盐母液:
通常配成100×浓缩液,配1L培养基时加10mL
螯合铁使得培养基pH升高至6~8时,铁离子仍保持二价,可被很好地吸收利用
***培养基母液的配制2
※有机物母液(维生素与氨基酸):
通常配成100×浓缩液,配1L培养基时加10mL
※植物激素母液:
通常配成0.1mg/mL浓缩液,配1L培养基时加xmL
◆常用生长素:
2,4-D,NAA配制时先用少量0.1mol/LNaOH溶解
◆常用细胞分裂素:
6-BA,KT配制时先用少量1mol/LHCl溶解
注:
母液配好后,注明名称、浓度、配制时间,4℃冰箱保存
培养基的配制程序
1、按照配方,精密量取准确体积的大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素母液于干净烧杯中
2、加入蔗糖(通常用量30g/L),溶解定容。
3、调pH=5.8NaOH和HCL调
如果是固体培养基,在调好pH后加入琼脂(通常用量7g/L),加热溶解后分装。
4、分装,封口,标记。
5、高压灭菌:
115℃,15min。
**8过滤消毒:
高压灭菌会破坏活性,有些物质需要进行过滤消毒加入到培养基:
0.45或0.22μm微孔滤膜进行过滤。
如激素、诱导子等。
***材料器械的消毒与无菌操作
植物材料的消毒
在充分清洗后(通常流水冲洗几小时),复合灭菌:
75%酒精灭菌0.5min,0.1%升汞灭菌5~20min。
消毒效果非常好。
消毒剂灭菌后一定要用无菌水充分清洗。
器械的消毒
玻璃器具高温灭菌:
121℃,30min;塑料枪头、枪头盒子、滤膜等:
115℃,15min
灭菌后烘箱内烘干;75%酒精消毒后拿入安全柜,部分进行火焰灭菌。
***灭菌sterilization方法
1、高压灭菌2、干热灭菌3、过滤灭菌4、药剂灭菌5、火焰灭菌
6、熏蒸灭菌:
KMnO4+HCHO实验室灭菌7、紫外灭菌:
无菌间及安全柜灭菌
***细胞计数
细胞鲜重和干重
减压抽滤后测得细胞鲜重(FCW),烘箱内烘至恒重,测得细胞干重(DCW)
有丝分裂指数
一个细胞群体中,处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。
衡量同步分裂的最好指标。
植板率:
平板法培养单细胞或原生质体时,细胞形成细胞团的频率=(平板上的细胞团数/平板上接种的细胞数)×100
***植物激素调控
离体细胞的器官与胚胎发生
PlanthormonesPlantgrowthregulators
激素的合理运用是植物细胞工程研究重要的基本方法:
器官分化和植株再生;获得最大细胞生物量和次生代谢物产量
***生长素和细胞分裂素
生长素:
组培中生长素添加为了促进离体细胞分裂形成愈伤组织,或诱导试管苗生根
强度:
2,4-D、NAA、IAA的强度比100:
10:
1
2,4-D:
2,4-dichlorophenoxyaceticacid
2,4-二氯苯氧乙酸
细胞分裂素:
组培中分裂素添加能诱导离体培养的芽形成丛生芽,诱导离体组织的细胞增殖,再生不定芽。
激动素(KT,kinetin)人工合成;6-BA(6-Benzyladenine)
赤霉素:
组培中GA3用于诱导离体芽的萌动和伸长
乙烯:
最普遍的功能是加速果实的成熟和组织的老化。
乙烯对组织培养物的生长、胚胎发生或芽的形成产生抑制作用,因此通过降低培养基中蔗糖的浓度,或用麦芽糖和葡萄糖代替蔗糖来抑制乙烯的产生。
脱落酸:
组培中主要用于胚胎或胚状体发育的后期,抑制胚胎的过早萌发,促进胚胎成熟,使胚胎长成形态正常的植株
生长素和细胞分裂素的协同作用:
较高浓度的生长素单独或与细胞分裂素结合使用可有效刺激培养细胞的增殖和连续生长,形成愈伤组织。
培养基中KT浓度高于IAA浓度时,培养物形成芽,不形成根;两者浓度大致相等时,只诱导愈伤组织发生,基本没有器官发生;当IAA浓度高于KT时,培养物分化出根,不形成芽。
这种KT和IAA浓度比例效应,适合于许多双子叶植物的组培。
其它类生长素和分裂素结合使用,效应相类似。
但并非绝对。
禾谷类植物的情况有所不同
2,4-D或2,4,5-T单独作用即可诱导禾谷类植物的幼嫩组织(幼胚和幼穗)产生愈伤。
其愈伤在低浓度生长素单独作用下,即可实现离体器官发生或胚胎发生,细胞分裂素并非必需。
***激素和其它化合物