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10参考样本实验研究类论文参考样本07张聪论文正文

摘要

目的：

人参蛋白及多肽主要具有抗脂质分解、抗血红细胞聚积、抗真菌、抗病毒、精氨酸酶活性等。

选择研究较少但活性多样的大分子－人参蛋白及多肽，通过现代分离纯化技术、活性检测技术及分析鉴定技术进行生物特性研究。

通过对不同参之间的蛋白成分进行比较和研究，对人参的一些多肽成分的分析和应用提供依据。

方法：

采用中药化学及生物化学提取法,结合离子交换、凝胶过滤层析和反相C18层析等现代生物分离技术,利用膜分离技术及柱层析技术对总蛋白进行分离纯化，结合细胞活性实验进行活性筛选，对人参中的蛋白及多肽进行了分离纯化，采用HPLC、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）及凝胶电泳图像分析软件等谱学技术，初步研究了这些蛋白多肤的结构,并从细胞水平进行了体外活性实验,探讨蛋白与多肤的生物活性。

结果：

采用现代生物层析分离技术从人参中分离纯化得到3个蛋白质单体化合物,分别为GSPⅠ、GSPⅡ及GSPⅢ。

经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱人参蛋白及多肽药理活性实验表明,人参蛋白GSPll对金黄色葡萄球菌具有抑制作用;对Hep-2细胞具有抑制作用，对3T3细胞具有增殖作用，且活性呈现一定量效关系。

关键词人参多肽提取工艺活性研究

ABSTRACT

Objective:

Ginsengproteinsandpolypeptide,whichhaveavarietyofbiologicalactivitiesbutlessreasearches,werestudiedbymoderntechnologiesincludingisolationandpurificationtechnology,activitydetectiontechnologyandanalysis-identificationtechnology.Providingabasisforidentificationandqualityevaluationamongginseng,wildginsengandAmericanginsengbyshowingacomparativestudyoftheirwater-solubleproteincomponents.

Methods:

Usingdifferentbuffer,differentratioofsolution,differentextractiontimetoextracttheginsengprotein,usingBradfordmethod,determintherateofproteinextractionfortheevaluationStandards,choosethebestoptimizedextractionprocess.Purificationwascarriedbyhollowfibersystemandcolumnchromatographytechnology,combinedwithcellactivitytoscreeningactivitycomponent.Comparethedifferenceoftheproteinsamongginseng,wildginsengandAmericanginsengｂｙusingSDS-polyacrylamidegelelectrophoresis（SDS-PAGE）andimageanalysissoftware.

Results:

ThreeproteinswereobtainedfromGinseng：

GSPⅠ、GSPⅡandGSPⅢ。

activityexperimentsshowthatithaveinhibitoryeffecton3T3cellsproliferationandhaveinhibitoryeffectonHep-2cellsproliferation,

KeywordsGinsengPolypeptideExtractionProcessPropert

目录

第一章文献综述1

1.1人参的发展趋势及待解决问题1

1.2人参蛋白的研究现状2

1.3蛋白质及多肽在中药鉴别中的重要地位4

1.4本课题研究的内容及意义4

第二章　材料与仪器6

2.1材料与试剂6

2.1.1原料6

2.1.2其它材料与试剂6

2.2仪器7

第三章　实验方法8

3.1人参多肽的分离纯化8

3.1.1人参多肽的提取制备8

3.1.2人参多肽的纯化8

3.1.3高效凝胶过滤色谱（HPGFC）检测8

3.1.4基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测8

3.2人参多肽的活性研究9

3.2.1细胞系9

3.2.2试剂配制9

3.2.3传代细胞培养10

3.2.4样品配制10

3.2.5MTT法检测人参多肽对细胞增殖的影响10

第四章实验结果12

4.1.人参多肽的分离纯化12

4.1.1人参多肽的提取制备12

4.1.2人参多肽的SephadexG-75层析图谱12

4.1.3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测13

4.1.4高效凝胶过滤色谱检测13

4.1.5基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测14

4.2人参多肽的活性研究15

4.2.1人参多肽对3T3细胞增殖影响15

4.2.2人参多肽对2BS细胞增殖影响16

4.2.3对Hep-2细胞增殖影响17

第五章讨论18

5.1人参多肽的分离纯化18

5.2人参多肽的活性研究19

致谢21

参考文献22

第一章文献综述

人参在我国医药史上具有极其特殊的地位，被誉为“百草之王”，是吉林省乃至全国的标志性中药材。

人参在我国中药中用途非常广泛，在中国药典、中国国家部颁标准中出现的次数均排在第一位。

现代医学研究证明，人参对中枢神经系统、心脑血管系统、呼吸系统、血液及造血系统、内分泌系统及生殖系统都具有良好的保护作用。

另外，研究证明，人参还具有明显的抗肿瘤、抗辐射、抗衰老和解毒功能。

由于人参的卓越滋补强壮作用和独特的医疗功效，因此吸引了许多化学家致力于有效成分之分离和鉴定。

由于化学分析方法的进步，近三十余年来，人参成分的分离、提纯和结构鉴定得到了重大的进展，迄今已知人参根中含有人参皂苷、多糖、挥发油、脂肪酸、甾醇、维生素、蛋白质、多肽等多种有效成分[1,2]。

但目前人们的研究主要集中于人参皂苷及挥发性成分研究，蛋白质及多肽的研究相对较少。

中药所含化学成分非常复杂。

目前，对这些成分的研究往往集中于糖、生物碱、苷类、挥发油等。

而另一些在中药里普遍存在的成分，尤其是蛋白质等生物大分子研究相对薄弱。

蛋白质作为一类重要的高分子化合物，存在于所有动物和植物的各种组织、细胞中，是生命存在的主要物质基础。

中药蛋白质不仅与中药的医疗作用有着密切的关系，而且对于鉴定中药的品种、质量以及加工炮制等都有重要意义。

1.1人参的发展趋势及待解决问题

目前人参的加工产品主要为红参,其加工方法为人参先蒸至熟,再加热烘干制成红参,外观上参体变得致密、角质、透明,颜色也由鲜参的黄白色变成棕褐色。

据报道在红参的加工过程中人参总皂普含量损失近32%,而生物大分子如蛋白质及多肽在加工过程中是否变性,结构如何变化,没有类似这些问题的研究报道。

生物大分子活性变化是人参加工工艺的重要参数,对于阐明人参产品药用机理具有重要意义。

从上述文献可以看出,人参在药用研究方面多从皂普考虑,生物大分子特别是多肽是作用及机理涉及太少,虽然近年从人参中分离蛋白质及多肽的工作正在兴起,但对于人参中所含的300种多肽与蛋白来说,这只是一个开始。

因此,运用现代生物技术从人参中分离出具有生物活性的多肽及蛋白质,并利用活性和结构两种方法研究其活性及结构变化规律,通过这些数据利用生物工程技术,为开发出高活性的生物药奠定基础。

长期以来，人们对人参皂甙和挥发油的研究较多。

而对于一些水溶性活性成分如人参蛋白及多肽的研究却较少。

目前的研究表明，人参蛋白及多肽主要具有抗脂质分解、抗血红细胞聚积、抗真菌、抗病毒、精氨酸酶活性等。

此外，在人参蛋白研究中，也存在一些问题。

一方面，偏重小分子蛋白即多肽的研究，对含量较高的大分子蛋白重视不够，对人参多肽的报道要远远多于人参大分子量蛋白。

其原因之一，就是许多研究人员认为多肽是药材的活性成分或有效成分，而大分子量蛋白应是结构蛋白或储存蛋白，并没有与药材相应的显著的临床疗效。

这就造成了研究大多以开发新药为目的，偏重药效或活性研究，对大分子蛋白在中药炮制加工和质量控制方面的作用重视不够。

另一方面，技术水平较低，研究不能深入。

关于人参蛋白的研究工作许多为10～20年前报道的，由于技术水平的限制，导致产品收率较低、纯度不高以及耗时较长，没有形成一个同时纯化多种蛋白的快速、高效纯化工艺路线，并且没有关于人参蛋白及多肽库这一领域的理论研究。

1.2人参蛋白的研究现状

　人参蛋白及多肽的研究始于六十年代,主要集中于人参多肽的提取方法。

1963年，德国的F.Gstirnor等人首次从人参根中检测出氨基酸：

谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸[3]。

1966年他们又采用电泳的方法从高丽白参的甲醇水提取液中得到5个小肽，未确定出一级结构[4]。

1980年，日本人Ando与Okada等发现人参水提取液中有一种强烈抑制肾上腺素诱导的脂肪分解的物质[5]，此物质能被链霉蛋白酶（pronase）破坏,估计为蛋白或肽类化合物。

经DEAE-Cellulose,SephadexG-10,Avicel-Cellulose,PhosphoricCellulose等色谱手段分得一个14肽，氨基酸组成为2Asp，Thr，Ser，3Glu，3Gly，Ala，Val，Leu,Il,未测出一级结构,之后也未查到继续研究此肽的报道。

1990年Takaku和Okada等又报道从高丽红参中得到一种酸性物质[6]，可以抑制肾上腺素诱导的脂肪分解并能刺激胰岛素参与的脂肪合成，并确定该酸性物质为焦谷氨酸。

同时他们还指出红参中可能有一种非肽物质也有此活性。

在此期间，韩国的Kim等报道从人参中分离纯化到有抗脂肪分解活性的寡肽[7]，但未给出一级结构。

Yagi等人1994年从人参中提取到一种四肽成分:

Val-D-Glu-D-Arg-Gly。

并证明一些非蛋白氨基酸对其调节神经系统活性至关重要。

魏俊杰等人[8]从生晒参中分离出两种人参多肽，分别是分子量为1000Da的11肽和分子量为1300Da的12肽，它们具有降低2BS细胞内多糖含量和增强2BS细胞内琥珀酸脱氢酶活力的作用。

Chen等[9]人利用水醇提取法,结合离子交换、凝胶过滤和RP-HPLC从人参中分离出六种含a氨基酸的小肽,并通过氨基酸序列分析已测定其结构为氧化性的谷胱甘肽及其类似物,实验证明,它具有调节动物睡眠的作用。

另外，一种结构为:

Glu-Thr-Val-Glu-Ile-Ile-Asp-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-Asp-Ala的14肽也是从人参中提取出来,,它具有强烈的抗脂解活性[10]。

吉林大学的张今等，1985年报道用717型和732型离子交换树脂柱从人参花蕾中分得两个酸性肽[11]，氨基酸组成分别为Ⅰ：

Asp-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-Mat-Leu-Phe-Arg分子量大于１５００；Ⅱ：

Asp-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-Ile-Leu-Lys，分子量大于1200。

1988年，他们又按照日本人Ando的分离程序及改进的分离程序（用SephadexG-25凝胶过滤）[12,13]从人参中分离出一个具有胰岛素作用的14肽,认为是Ando得到的14肽，但存在一个氨基酸的差异,并用DABITC/PICTC双偶合法测定了序列为Glu-Thr-Val-Glu-Ile-Ile-Asp-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-Asp-Ala。

其后，又用CD谱研究了该肽的研究二级结构[14]；生理活性研究表明有抗脂肪分解及降低血糖和肝糖作用[15,16]；对该肽的基因进行了化学合成和克隆[17]。

白求恩医科大学的徐景达等也从事了这方面的工作，1990年报道从人参中用DEAE-Cellulose和HPLC纯化了两个肽[8]，氨基酸组成分别为Ⅰ：

2Asp,2Ser,3Glu,3Gly,Ala,Lys，分子量1300左右；Ⅱ：

2Asp,2Ser,3Glu,2Gly,Ala,Pro，分子量1000左右。

1991年又报道从红参中经DEAE-Cellulose，SephadexG-10和RP-HPLC纯化得到两个肽[18],其一为13肽，3Gly,2Ser,2Glu,Ala,2Asp,Thr,Leu,Val；另一为15肽，4Gly,3Ser,2Glu,2Ala,Asp,Thr,Leu,Ile。

测出了15肽的N末端为Asp，各肽均未给出一级结构。

进入90年代中期，由于现代生物技术在中药领域的广泛应用，对于人参蛋白的研究才日益增多。

应用二维电泳技术现已表明人参中共有人参蛋白300多种，其中已被报道的仅有40多种[19,20]，主要包括：

（1）类RNA酶蛋白：

类RNA酶蛋白是人参的主要蛋白（ginsengmajorprotein，GMP），分子量为28kDa，其氨基酸序列与植物的RNA酶具有高度同源性。

二维电泳分析显示GMP的含量随季节的变化而变化，因此这一蛋白也被认为是人参的储存蛋白。

（2）核糖核酸酶：

Lam和Ng从人参根中分离得到一种由27kDa和29kDa两个亚基组成的非耐热核糖核酸酶，其具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。

随后他们又从人参花蕾中分离得到一分子量23kDa的核糖核酸酶，但却没有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。

Gennady也从人参愈伤组织中分离得到两种分子量都为18kDa的核糖核酸酶[21]。

（3）几丁质样蛋白：

分子量15kDa，具有抗真菌功能[25]。

（4）木聚糖酶：

从人参根部提取的木聚糖酶，分子量只有15kDa，明显低于从其他药用植物分离得到木聚糖酶，最适酶活温度为50℃，具有人I型免疫缺陷病毒转录抑制的活性。

（5）皂苷ß-葡萄糖苷酶：

从人参中分离的皂苷ß-葡萄糖苷酶能水解人参皂苷Rg3，得到抗癌物质人参皂苷Rh2，分子量59kDa，最适酶活温度为60℃。

1.3蛋白质及多肽在中药鉴别中的重要地位

一味正品药材，不但要求基原正确，性状、显微特征无误，还必须对中药材所含的有效成分、主成分或特征性成分等指标成分进行定性、定量分析。

而这些指标成分往往集中于糖、生物碱、苷类、挥发油等。

动、植物类中药细胞中普遍含有受遗传基因控制的蛋白质分子，且有种的特异性和稳定性，因此，利用蛋白质种类的不同来鉴别那些亲缘关系相近、性状类同的中药是有理论依据的，在实验方法上也是有效可行的[22]。

利用这一规律，以蛋白质分子为指标进行中药鉴别，对于丰富中药质量标准体系是非常重要的。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一种经典技术在蛋白质研究中被广泛应用。

应用这一技术，可以根据电泳的蛋白谱带数、泳动率、着色深浅、特征蛋白分子量等来进行中药鉴定及质量研究。

由于传统的性状鉴别易受人为因素影响，通常需要多种方法配合才能准确鉴定。

目前，中药鉴定的发展方向是中药鉴别客观化、标准化、现代化。

凝胶电泳鉴别技术,为中药鉴别学科开辟了新的领域,并提供了一项新的检测手段和生化指标，使中药鉴别方法更趋合理和完善[23]。

1.4本课题研究的内容及意义

蛋白质的复杂结构导致其物理和化学性质的不稳定，很多因素都可以导致其变性失活，因此在蛋白质提取分离过程中，要综合各影响因素所带来的不利影响，本文综合考察了不同pH值、不同料液比、不同浸提时间等影响因素对蛋白提取率的影响,确定了最佳提取工艺。

传统的蛋白质提取方法是：

采用中性缓冲液浸提，硫酸铵沉淀获得总蛋白。

此方法操作繁琐且收率和纯度很低,不利于大规模生产[24-28]。

本文通过正交试验结合膜分离技术，建立了一种获得高纯度、高收率人参蛋白的提取方法。

同时，本文采用等电点分离结合凝胶过滤层析技术，从人参总蛋白中分离纯化出了分子量为5027Da的人参多肽，并对其理化性质及活性进行研究，为人参药材药用价值的发挥及有效成分研究奠定了基础。

第二章　材料与仪器

2.1材料与试剂

2.1.1原料

鲜参、山参、西洋参购于吉林省抚松县，采集时间为2010年9月共20批样品均属于五加科植物人参（PanaxgisengC.A.Mey.）野山参是指野外自然生长的人参。

西洋参为五加科植物西洋参（PanaxquinquefoliumL.），生长年限为4年、5年。

2.1.2其它材料与试剂

三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）　　　Genview电泳纯

磷酸氢二钠（Na2HPO4）　　北京化工厂分析纯

磷酸二氢钠（NaH2PO4）　　北京化工厂分析纯

甘氨酸　　Sigma电泳纯

丙烯酰胺　　Sigma电泳纯

过硫酸铵　　Sigma电泳纯

十二烷基硫酸钠（SDS）　　Sigma电泳纯

β-巯基乙醇　　Genview电泳纯

N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）Amresco电泳纯

考马斯亮蓝R250　　Sigma电泳纯

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白上海生物化学研究所

Bradford蛋白含量试剂盒　　Sigma公司产品

MTT　　Sigma公司产品

DMSO　　Sigma公司产品

胰蛋白酶　　Gibco公司产品

DMEM培养基　Gibco公司产品

2.2仪器

名称型号厂家

电子天平　　　　　DT100　　　　常熟市双杰测试仪器厂

电子天平　　　　　TA1203N　　上海精密科学仪器有限公司

超声波清洗器　　　KQ-3200B　　　昆山市超声仪器有限公司

循环水式多用真空泵　SHB-3　　　　郑州杜甫仪器厂

微机型酸度计　　　pHS-25CW　　上海理达仪器厂

高速组织捣碎机　　DS-1　　　　　上海标本模型厂

冷冻干燥机　　　　LL3000　　　　德国Heto公司

磁力搅拌器　　　　JB-1B　　　　上海雷磁新泾仪器有限公司

漩涡混合器　　　　XW-80A.H-1　上海精科实业有限公司

高效液相色谱仪　　1100　　　　　美国Angilen公司

超纯水机　　　　　WP-RO-20　　四川沃特尔仪器有限公司

台式大容量离心机　TDL-5　　　　上海安亭科学仪器厂

高速离心机　　　　Mini　　　　　Eppendorf公司

垂直板电泳槽　　　DYCZ-24D　　北京六一仪器厂

电泳仪　　　　　　DYY-8C　　　北京六一仪器厂

紫外可见分光光度计　UVmini-1240　日本岛津公司

凝胶排阻液相色谱柱TSK-G2000SWxlTOSOH公司

酶标仪　　　　　　MultiskanMK3Thermo公司

倒置生物生物显微镜　XSB-1A　　　中国广西梧州市学仪器厂

中空纤维膜过滤系统QuixStand　　　GEHealthcare

中空纤维过滤柱　　0.65μm　　　GEHealthcare

纤维过滤膜堆　　　100kD　　　　GEHealthcare

凝胶电泳图像分析系统JD801　　　　江苏省捷达科技有限公司

二氧化碳培养箱　　HERAcell150　Thermo公司

双人净化工作台　　SW-CJ-2D　　苏州净化设备有限公司

高压灭菌器　　　　01J2003－OA　上海博迅实业有限公司

第三章　实验方法

3.1人参多肽的分离纯化

3.1.1人参多肽的提取制备

取本实验制备的人参总蛋白样品100mg，10mMpH7.4的PBS缓冲溶液溶解，置于截留分子量为6000-8000Da的醋酸纤维素透析带中，对10mMpH6.5的醋酸铵缓冲溶液透析，6000rpm离心15min，沉淀用含2M盐酸胍的10mMpH7.4的PBS缓冲溶液溶解，经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱分离，收集外率液，再经截留分子量为1KD的中空纤维超滤柱除盐并浓缩，真空冷冻干燥机冻干，得人参多肽粗品。

3.1.2人参多肽的纯化

取人参多肽粗品10mg，用10mMpH7.4的PBS缓冲溶液溶解，0.22µm滤膜过滤，经SephadexG-75凝胶柱层析分离，收集洗脱峰。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测

按3.1.3项下步骤进行电泳检测。

3.1.3高效凝胶过滤色谱（HPGFC）检测

排阻极限：

5-150kD，流动相：

20mM磷酸盐缓冲溶液含（10mM硫酸钠），柱温：

25℃，流速：

0.5ml/min，检测波长：

280nm。

3.1.4基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测

将人参多肽纯品用去离子水稀释至约1×10-6mol/L，取10μl此稀释液，加入等体积的芥子酸混匀，再加入1μl的0.1%三氟乙酸水溶液混匀。

取1μl此溶液滴于进样探头上抽空除去溶剂，使样品/基质混合物在探头上形成均匀的结晶，直接进样分析。

质谱信号为单次扫描累加50次，以正离子谱测定。

3.2人参多肽的活性研究

3.2.1细胞系

3T3细胞株；2BS细胞株；Hep-2细胞株。

3.2.2试剂配制

（1）培养基

将一袋DMEM培养基全部倒入一容器中，用少量去离子水将袋内残留培养基洗下，并入容器。

加去离子水（水温20℃～30℃）到950ml，轻微搅拌溶解后，加入2.438g碳酸氢钠，轻微搅拌溶解，加去离子水至1L。

用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH值为7.2，用0.2µm滤膜过滤除菌，4℃保存。

（2）青、链霉素混合液（简称S．P．液或双抗液）

青霉素（40万U）5支，链霉素（200万µg）1支，分别溶于100ml灭菌去离子水中或共同溶于200ml灭菌去离子水中，混合后分装小瓶，置-20℃冰箱保存备用（1万单位µg/ml）。

临用时，按1%的量加入培养液中，最后浓度是青霉素100U/ml，链霉素100µg/ml。

（3）PBS缓冲液

称取0.20gKCl，8.00gNaCl，0.20gKH2PO4,1.56g，Na2HPO4•H2O加去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌（121℃，20min），用无菌NaHCO3溶液调节pH值至7.2～7.4，分装，4℃保存。

（4）Hanks’平衡盐溶液

取NaCl8.00g，KCl0.40g，CaCl20.14g，MgSO4•7H2O0.20g，Na2HPO4•H2O0.06g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g，葡萄糖1.00g，酚红0