高效液相色谱操作指引.docx

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高效液相色谱操作指引

洋紫荆油墨（中山）有限公司

支持性文件

文件编号：

BVL-SOP-

版本：

A/0

生效日期：

2012.5.20

文件名称

Aglient1260高效液相操作指引

修订状态：

0

页码：

1/8

一．目的

规范Aglient1260高效液相色谱仪的操作及维护保养。

二．范围

适用于实验室相关人员的操作及人员培训。

三.职责：

检测员负责使用和维护保养，设备管理员负责管理及期间核查。

四．操作步骤

1.开机

1）配制各流动相，放入各自溶剂瓶中，超声脱气20min。

2）打开计算机，登陆windows操作系统。

3）打开主机各模块电源（不分先后，1260会根据需要自动关闭紫外灯），不管用DAD检测器还是用FLD检测器，紫外检测器电源均需要打开以保持各模块通信。

待各模块完成自检后，再双击桌面“仪器1联机”图标,进入化学工作站。

4）从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面，正常情况会默认进入此界面。

5）确保对应溶剂瓶装入所要使用的流动相，左击“四元泵”模块下的“溶剂瓶”图标或右击“四元泵”下选择“瓶填充”，输入溶剂的实际体积和瓶总体积，可输入停泵的体积。

单击“确定”。

（注意：

此操作很重要，以免气泡进入系统）。

6）旋开排气阀（逆时针，缓缓旋开约1/4即可），右单击“四元泵”图标出现快捷键，点击“方法”选项进入泵编辑画面。

将泵流量设到5ml/min，溶剂A设到100%，单击“确定”。

右击“四元泵”图标，选择“控制”选项，选中“打开”，单击“确定”，则系统开始排气，直到管线内无气泡为止；依此切换到B、C、D溶剂同法继续排气，直到所有要用通道无气泡为止（只需排所用到的通道即可）,查看柱前压力（若大于10bar，则应更换排气阀内过滤白头）。

备注：

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BVL-SOP-

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生效日期：

2012.5.20

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Aglient1260高效液相操作指引

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7）将泵的流量设到所用方法的流量，如：

1.5ml/min，调所用的方法，多元泵则根据方法设定溶剂配比；关闭排气阀（顺时针）。

8）待柱前压力基本稳定后,打开检测器灯，观察基线情况。

基线平稳后则可以进行样品的测试（一般20分钟左右基线则可达到平稳状态）。

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生效日期：

2011.4.1

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2.数据采集方法编辑

1）编辑样品信息：

由“运行控制”进入“样品信息”，设定操作者姓名，样品数据文件名等。

2）编辑完整方法：

从“方法”菜单中选择“编辑完整方法”项.选中项单击“确定”入下一画面“方法注释”，编辑好单击“确定”进入下一画面“选择进样源/位置”，选中Als单击“确定”入下一画面“设置方法”进行参数设定。

3）四元泵参数设定：

在“流速”处输入流量,如1mL/min,在“溶剂”处选中B输入80%（A=100-B-C-D），在右面注释栏中标明各溶剂的名称；设置“停止时间”和“后运行时间”，在“压力限值”处输入柱子的最大耐高压以保护柱子如：

250bar，以保护柱子，在“时间表”添加编辑梯度。

4）进样器参数设定：

在进样模式中输入进样量xxul。

“标准进针”——只能输入进样体积此方式无洗针功能。

“针清洗后进样”——可以输入进样体积和洗瓶位置为xx，此方式针从样品瓶抽完样品后会在洗瓶中洗针。

5）进样器进样程序参数设定：

选中使用进样程序，在“函数”中添加相应函数即可按程序进样。

6）TCC检测器参数设定：

在“温度”左侧下面的方框内输入所需温度,并选中它,右侧选中“与左侧相同”——使柱温箱的温度左右一致。

7）DAD检测器参数设定：

在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在“峰宽（响应时间）”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间,如>0.1min（2s）,再设置“停止时间”和“后运行时间”。

FLD则需要设发射波长和激发波长，同时可以设定需要保存的光谱。

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8）仪器曲线设置：

默认即可。

9）方法编辑完，在“方法”菜单中选则“方法另存为”为新建方法命名，单击“确定”。

3.数据采集方法

1）在“序列”菜单中选择“序列参数”，在弹出对话框中输入操作者名称，数据存储目录路径中的子目录，子目录即为数据图谱存储的文件夹，请认真填写，输入后，鼠标点击其他处，会自动弹出“E:

\---不存在，要创建它吗？

”单击“确定”，再选择“手动”或“前缀/计数器”。

2）编辑序列表：

在“序列”菜单中选择“序列表”，在表格中可进行“插入”、“剪切”等操作，表格中必须填写“样品瓶”、“样品名称”、“方法名称”、“进样次数”、“数据文件”、“进样量”等信息，其他信息可选择编辑。

编辑完成后，单击“确定”。

在“序列”菜单中选择“序列模板另存为”，为新建序列命名。

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3）色谱柱安装完成后，在“仪器”菜单中选择“系统开启”或单击界面右侧绿色的“打开”快捷键，平衡色谱柱，等基线平稳，在“仪器”菜单中选择“运行序列”。

停止采集数据选择“仪器”菜单中“停止运行/进样/序列”。

4.数据处理

1）从“视图”菜单中单击“数据分析”进入数据分析画面，或直接双击仪器脱机模式进行操作。

2）从“文件”菜单选择“调用信号”选中您的数据文件名，单击“确定”。

3）谱图优化,从“图形”菜单中选择“信号选项”从“范围”中选择“自动量程”及合适的显示时间单击“确定”,或选择”自定义量程”调整,反复进行直到图的比例合适为止。

4）积分:

打开低浓度标液谱图，从“积分”中选择“自动积分”,积分结果不理想,再从菜单中选“积分事件”，选项选择合适的“斜率灵敏度,峰宽,最小峰面积,最小峰高”.从“积分”菜单中选择“积分”选项则数据被积分.如积分结果不理想则修改相应的积分参数直到满意为止。

单击左边图标将积分参数存入方法。

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5）校正表设计：

点击“校正”菜单中的“校正设置”，给出各个参数：

点击“确定”；调出建立校正表所需的谱图并对谱图进行图形优化和积分优化；点击“校正”菜单中的“新建校正表；在“新建校正表”栏里选定“自动设定”点击“确定”；在“校正表”中给出正确的“化合物名”和“含量”，其它的非目标峰则删除掉；如需增加校正点数，则打开相应的谱图，点击“校正”，点击“添加级别”设定相应的级别，点击“确定”，所有校正级别完成后，点击“保存图标”将校正表存入方法中。

后续如果需要更新，则点击“校正”，点击“重新校正”，选择对应的级别及模式，然后另存为新的名字则可。

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6）打印报告:

从“报告”菜单中选择“设定报告”选项进入画面:

单击“定量结果”框中“定量”右侧的黑三角选中“外标法”，其它选项不变单击“确定”.从“报告”菜单中选择“打印”则报告结果将打印到屏幕上如想输出到打印机上则单击“报告”底部的“打印”钮。

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5.关机

1）关机前，用90%水冲洗柱子和系统0.5小时，流量1mL/min，再用90%有机溶剂冲0.5小时，然后关泵（适于反相色谱柱）。

[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

2）退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机。

3）关掉主机电源开关。

注意事项：

1）氘灯是易耗品，应最后开灯，不分析样品即关灯。

2）开机时，打开排气阀，100%水，泵流量5ml/min，若此时显示压力>10bar，则应更换排气

阀内过滤白头。

3）流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。

4）流动相使用前必须进行脱气处理，可用超声波振荡10-15min。

5）泵头密封清洗装置（SealWash）所用的10%异丙醇，也需要每天更换，且不能干涸。

常见色谱故障及可能原因

故障

可能原因

基线噪音

1.检测池脏

2.检测池灯能量下降

3.由泵引起的脉冲

4.检测器上的温室效应

5.检测池中有气泡通过

基线漂移

1.梯度洗脱所用溶剂有吸收

2.流动相脏

3.色谱柱没有用流动相平衡

4.系统中污染物溢出

5.实验温度不稳定

鬼峰

1.流动相脏

柱外扩散

1.柱外死体积增大

双峰

1.柱头塌陷或柱床运动

2.柱前滤芯堵塞

3.组分共流出

4.样品量过大

5.进样器的进样流路存在分叉流路

备注：

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拟制

审核

批准

出师表

两汉：

诸葛亮

　　先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。

然侍卫之臣不懈于内，忠志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。

诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气，不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。

　　宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。

若有作奸犯科及为忠善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使内外异法也。

　　侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：

愚以为宫中之事，事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补阙漏，有所广益。

　　将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰“能”，是以众议举宠为督：

愚以为营中之事，悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。

　　亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也；亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。

先帝在时，每与臣论此事，未尝不叹息痛恨于桓、灵也。

侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣，愿陛下亲之、信之，则汉室之隆，可计日而待也

。

　　臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。

先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于草庐之中，咨臣以当世之事，由是感激，遂许先帝以驱驰。

后值倾覆，受任于败军之际，奉命于危难之间，尔来二十有一年矣。

　　先帝知臣谨慎，故临崩寄臣以大事也。

受命以来，夙夜忧叹，恐托付不效，以伤先帝之明；故五月渡泸，深入不毛。

今南方已定，兵甲已足，当奖率三军，北定中原，庶竭驽钝，攘除奸凶，兴复汉室，还于旧都。

此臣所以报先帝而忠陛下之职分也。

至于斟酌损益，进尽忠言，则攸之、祎、允之任也。

　　愿陛下托臣以讨贼兴复之效，不效，则治臣之罪，以告先帝之灵。

若无兴德之言，则责攸之、祎、允等之慢，以彰其咎；陛下亦宜自谋，以咨诹善道，察纳雅言，深追先帝遗诏。

臣不胜受恩感激。

　　今当远离，临表涕零，不知所言。