柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达.docx

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柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达

　　[摘要]目的构建重组质粒柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirusgroupAtype16，CA16）VP1，并进行原核表达及鉴定。

方法用PCR方法扩增CA16VP1序列，构建其重组表达质粒pET21b-CA16VP1，并转入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）进行诱导表达及纯化，SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物，间接ELISA方法检测重组蛋白CA16VP1的抗原性和有效性。

结果成功原核表达并纯化了CA16VP1蛋白，可与小鼠抗CA16病毒血清特异性结合，与太原市老年人群中部分血清存在高反应性。

结论CA16VP1蛋白获得成功表达，ELISA检测具有良好的抗原性和有效性，为CA16诊断试剂盒的研究奠定基础。

　　[关键词]柯萨奇病毒A组16型；VP1蛋白；原核表达；酶联免疫吸附

　　[中图分类号]R373.2；R392-33[文献标识码]B[文章编号]1673-9701（2014）14-0069-04

　　手足口病（Handfootandmouthdisease，HFMD）是一种全球性的传染病，自1957年新西兰首次报道以来[1]，世界各地均有不同程度的流行[2-5]。

近年来，手足口病疫情呈不断上升的趋势，尤其在亚太地区。

2008年，我国将其列为法定丙类传染病进行监测，目前HFMD的发病率和死亡率在丙类传染病中仍居首位。

引起HFMD的肠道病毒有20多种，其中柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirusgroupAtype16，CA16）和EV71最为常见[6]，其他肠道病毒像CA4、CA5、CA9、CA10、CB2和CB5也可以引起[7]。

CA16基因组全长7410bp，其中VP1基因长891bp，编码297个氨基酸残基[8]，CA16VP1含有许多线性中和表位，VP1基因与肠道病毒血清型完全对应，可作为肠道病毒属内不同血清分类依据，也可作为小RNA病毒科分类依据[9]。

因此，CA16VP1基因已成为研究CA16的重要对象。

本实验旨在构建pET21b-CA16VP1重组表达质粒，在大肠杆菌中原核表达并纯化CA16VP1重组蛋白，并检测其抗原性和有效性，为CA16诊断试剂盒的研究奠定基础。

　　1材料与方法

　　1.1质粒、菌株、细胞、病毒及试剂

　　原核表达载体pET21b购自Novagen公司，大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）和Top10菌株购自TAKARA公司。

CA16病毒和RD细胞由上海市疾病预防控制中心提供。

限制性核酸内切酶BamHI、HindIII和DNAMarker（DL2000）购自宝生物工程（大连）有限公司；TaqDNA聚合酶试剂盒购自天根生化科技有限公司；T4DNA连接酶（LigationHighkit）购自东洋纺（中国上海）生物科技有限公司；PCR小量胶回收试剂盒购自北京天恩泽科技有限公司。

金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA）购自德国QIAGEN公司。

重组质粒pET32a-CA16VP1、纯化的pET32a蛋白和LD5由第二军医大学病原生物学教研室制备并保存，其中LD5为一种新型免疫球蛋白结合分子（NEIBM），可与Ig的VH3和Vk区域双结合，与IgG有较高的亲和力[10-12]。

　　1.2实验动物及血清标本

　　清洁级BALB/C小鼠，雌性，6周龄，16～18g，由第二军医大学实验动物中心提供；2013年5月29日～5月30日山西医科大学第二附属医院检验科95份太原市老年人血清，其中男48例，女47例，平均年龄（61.0±14.0）岁。

　　1.3引物的设计及合成

　　根据CA16VP1基因（NCBI登录号：

AEO12126.1）序列自行设计引物，上游P1：

5′-GGCCCGGGGATCCGGGTGACCCGATCGCTGAC-3′（下划线部分为BamHI酶切位点），下游P2：

5′-CGCCCGCGGAAGCTTCAGAGTAGTGATTTTGTC-3′（下划线部分为HindIII酶切位点），扩增片段大小为891bp。

引物由上海生工生物有限公司合成。

　　1.4CA16VP1基因的扩增

　　以pET32a-CA16VP1质粒为模板，P1、P2为上下游引物，PCR扩增CA16VP1基因，PCR扩增条件为：

94℃预变性5min；4℃30s，55℃30s，72℃40s，共35个循环；72℃延伸10min。

1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

　　1.5重组表达质粒的构建

　　将试剂盒回收的PCR产物和表达载体pET21b用BamHI和HindIII双酶切，回收目的基因片段和载体片段，以T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化到感受态E.coliTOP10中，过夜培养后挑取单克隆菌落，37℃摇菌16h后提取质粒，用BamHI和HindIII双酶切鉴定。

鉴定正确的质粒送上海杰李生物技术有限公司测序。

　　1.6重组蛋白的表达

　　将测序正确的重组质粒转化至E.coliBL21（DE3）中，挑取单克隆菌落，接种于2mLLB（100μg/mLAmp+15μg/mLKana）培养基中，37℃培养7h，按1%接种量接种到50mLLB培养基中，37℃、230rpm振荡培养过夜；将50mL过夜菌液转接至新鲜的450mLLB中，37℃、230rpm振荡培养至A600为0.6，加IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导4h，离心收集细菌沉淀，在冰浴的条件下超声300次，每次超声3s，间隔3s；离心收集上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE分析。

　　1.7重组蛋白的纯化　　取重组菌破菌沉淀，加8mol/L（pH8.0）尿素10mL重悬，4℃裂解过夜；离心收集上清用于纯化，纯化按Qiagen公司Ni-NTA说明书进行。

12%SDS-PAGE分析，BandScan软件分析重组蛋白的纯度。

　　1.8小鼠抗CA16病毒血清的制备

　　将RD细胞接种到培养瓶中，当RD细胞长满80%时，加入CA16病毒悬液，37℃，5%的CO2培养箱中培养4～5d，收集细胞并反复冻融三次，离心收集病毒悬液并腹腔注射5只BALB/c小鼠，病毒剂量按200μL/只，共注射3次，每次间隔2周。

第3次注射后1周采血，分离血清。

　　1.9间接ELISA法检测重组蛋白的抗原性及有效性

　　将重组蛋白pET21b-CA16VP1和pET32a用100mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）以1：

200稀释，分别包被于酶标板100μL/孔，37℃孵育2h，弃上清；10%的脱脂奶粉37℃封闭2h；每孔加入2倍系列稀释（1：

20～1：

5120）的小鼠抗CA16病毒血清和太原市老年人血清100μL，37℃孵育45min，PBST洗液洗4次；加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的LD5100μL，37℃孵育45min；PBST洗液洗4次，TMB显色液显色，于450nm波长处测定吸光度值（A450）。

　　1.10统计学方法

　　实验数据使用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据符合偏态分布，两组间比较采用两独立样本的秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义，采用GraphPadPrism5软件进行作图分析。

　　2结果

　　2.1CA16VP1基因的扩增

　　以pET32a-CA16VP1质粒为模板，P1、P2为上下游引物，PCR扩增CA16VP1基因，CA16VP1基因经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，可见891bp的特异性条带，大小与理论值相符，见图1。

　　2.2pET21b-CA16VP1质粒的鉴定

　　重组质粒pET21b-CA16VP1经BamHI和HindIII双酶切，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，可见约5400bp的载体片段和891bp的目的基因片段，与理论值相符，见图2。

　　M：

DL2000Marker；1：

未酶切pET21b-CA16VP1；

　　2：

pET21b-CA16VP1双酶切后产物

　　2.3CA16VP1蛋白的表达

　　将pET21b-CA16VP1质粒转入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中诱导表达，经12%SDS-PAGE检测，结果可见相对分子质量约34KDa的条带，大小与理论值相符，重组蛋白pET21b-CA16VP1主要存在于破菌沉淀中，以包涵体形式表达。

经BandScan软件分析，目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的24%，见图3。

　　2.4CA16VP1蛋白的纯化

　　重组蛋白CA16VP1经Ni-NTA亲和层析纯化后，12%SDS-PAGE检测，结果可见相对分子质量约34KDa的单一蛋白条带，经BandScan软件分析，重组蛋白的纯度达90%以上。

见图4。

　　2.5CA16VP1的抗原性分析

　　5只BALB/c小鼠经CA16病毒4次免疫后，用间接ELISA方法检测纯化的重组蛋白CA16VP1与倍比稀释的小鼠抗CA16病毒血清的反应性，结果显示，小鼠抗CA16病毒血清可与纯化的重组蛋白特异性结合，A450值随小鼠抗CA16病毒血清浓度的稀释逐渐降低，以1∶20～1∶60稀释度下降尤为明显，与pET32a蛋白仅有较弱的结合，见图5。

　　2.6CA16VP1的有效性分析

　　95份太原市老年人血清与重组蛋白CA16VP1的间接ELISA检测，结果显示：

重组蛋白CA16VP1与太原市老年人血清反应的A450（中位数0.912，四分位数间距0.638）明显高于对照组pET32a蛋白与人血清反应的A450（中位数0.486，四分位数间距0.172），差异有统计学意义（P<0.01），见图6。

将重组蛋白CA16VP1与太原老年人血清反应的A450值从高到低依次排列显示，A450值呈线性分布，出现高、中、低三种A450值，而且有7例血清的A450值明显高于其他人血清的A450值，见图7。

　　3讨论

　　以往研究认为CA16仅引起轻微症状[13]，EV71能引起严重的并发症及死亡率[14，15]，因此大多数手足口病的研究主要针对EV71，CA16常被忽视。

然而近几年研究发现，感染CA16的患者也能引起严重并发症[16]，甚至死亡[17]，CA16日益受到人们的重视。

　　本实验构建了重组表达质粒pET21b-CA16VP1，并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了CA16VP1蛋白，SDS-PAGE分析显示，表达的重组蛋白CA16VP1主要以包涵体形式存在，之所以出现包涵体是因为这些蛋白在体内过量表达，以至于没有足够的时间正确折叠，二硫键不能正确地配对，过多的蛋白间非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度[18]，重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后纯度达90%以上，由于载体蛋白pET21b分子量很小，仅含有27个氨基酸，因此，选择pET32a载体蛋白作为阴性对照。

　　为确定重组蛋白CA16VP1是否具有抗原性，我们用小鼠抗CA16病毒血清来检测重组蛋白CA16VP1，结果表明，重组蛋白CA16VP1与小鼠抗CA16病毒血清的反应明显高于与pET32a蛋白的反应，表明CA16VP1蛋白具有良好的抗原性和特异性。

本实验结果还显示，在每个血清稀释下，5只小鼠抗CA16病毒血清与重组蛋白CA16VP1反应的A450值有高有低，而与pET32a蛋白反应的A450值均小于0.5且它们之间的差异很小，表明不同小鼠对相同CA16病毒产生的抗体不同，小鼠之间存在个体差异；小鼠抗CA16病毒血清与pET32a蛋白无结合反应。

　　为进一步了解重组蛋白CA16VP1能否有效检测人群中抗CA16VP1抗体，我们用表达的重组蛋白CA16VP1检测太原市老年人血清，结果表明，重组蛋白CA16VP1作为抗原能有效检测人群中抗CA16VP1抗体，有7例血清与重组蛋白存在高的结合反应，表明表达的重组蛋白能够成为一种临床检测用抗原。

由于本次实验没有对这7例血清进行中和实验来确定他们是否感染过CA16病毒，有待我们在后续的实验中进一步验证。

　　综上所述，本实验成功构建了重组表达质粒pET21b-CA16VP1，原核表达并纯化了CA16VP1重组蛋白，能与小鼠抗CA16病毒血清发生特异性反应，能检测出人血清中抗CA16抗体，说明其具有良好的抗原性和有效性，本实验为CA16诊断试剂盒的研究奠定基础。

　　[参考文献]

　　[1]SarmaN.Hand，foot，andmouthdisease：

CurrentscenarioandIndianperspective[J].IndianJDermatolVenereolLeprol，2013，79

（2）：

165-175.

　　[2]WuY，YeoA，PhoonMC，etal.Thelargestoutbreakofhand，footandmouthdiseaseinSingaporein2008：

Theroleofenterovirus71andcoxsackievirusAstrains[J].IntJInfectDis，2010，14（12）：

e1076-1081.

　　[3]BendigJW，FlemingDM.Epidemiological，virological，andclinicalfeaturesofanepidemicofhand，foot，andmouthdiseaseinEnglandandWales[J].CommunDisRepCDRRev，1996，6（6）：

R81-86.

　　[4]KobayashiM，MakinoT，HanaokaN，etal.ClinicalmanifestationsofcoxsackievirusA6infectionassociatedwithamajoroutbreakofhand，foot，andmouthdiseaseinJapan[J].JpnJInfectDis，2013，66（3）：

260-261.

　　[5]PuenpaJ，TheamboonlersA，KorkongS，etal.Molecularcharacterizationandcompletegenomeanalysisofhumanenterovirus71andcoxsackievirusA16fromchildrenwithhand，footandmouthdiseaseinThailandduring2008-2011[J].ArchVirol，2011，156（11）：

2007-2013.

　　[6]ZhuZ，ZhuS，GuoX，etal.Retrospectiveseroepidemiologyindicatedthathumanenterovirus71andcoxsackievirusA16circulatedwildlyincentralandsouthernChinabeforelarge-scaleoutbreaksfrom2008[J].VirolJ，2010，7：

300.

　　[7]AngLW，KohBK，ChanKP，etal.Epidemiologyandcontrolofhand，footandmouthdiseaseinSingapore，2001-2007[J].AnnAcadMedSingapore，2009，38

（2）：

106-112.

　　[8]金奇.医学分子病毒学[M].北京：

科学出版社，2001：

579-602.

　　[9]ObersteMS，Maher，KilpatrickDR，etal.Molecularevolutionofthehumanenteroviruses：

CorrelationofserotypewithVP1sequenceandapplicationtopicornavirusclassification[J].JVirol，1999，73（3）：

1941-1948.

　　[10]CaoJ，ChenQ，ZhangH，etal.Novelevolvedimmunoglobulin（Ig）-bindingmoleculesenhancethedetectionofIgMagainsthepatitisCvirus[J].PLoSOne，2011，6（4）：

e18477.

　　[11]JiangSH，WangJF，XuR，etal.AlternatearrangementofPpLB3domainandSpADdomaincreatessynergisticdouble-sitebindingtoVH3andVkapparegionsoffab[J].DNACellBiol，2008，27（8）：

423-431.　　[12]QiuliChen，LanLi，WentingLiao，etal.CharacterizationoftatantibodyresponsesinChineseindividualsinfectedwithHIV-1[J].PLoSOne，2013，8（4）：

e60825.

　　[13]ChangLY，LinTY，HuangYC，etal.Comparisonofenterovirus71andcoxsackie-virusA16clinicalillnessesduringtheTaiwanenterovirusepidemic，1998[J].PediatrInfectDisJ，1999，18（12）：

1092-1096.

　　[14]McMinnPC.Anoverviewoftheevolutionofenterovirus71anditsclinicalandpublichealthsignificance[J].FEMSMicrobiolRev，2002，26

（1）：

91-107.

　　[15]LeeTC，GuoHR，YangYC，etal.Diseasescausedbyenterovirus71infection[J].PediatrInfectDisJ，2009，28（10）：

904-910.

　　[16]XuW，LiuCF，YanL，etal.Distributionofenterovirusesinhospitalizedchildrenwithhand，footandmouthdiseaseandrelationshipbetweenpathogensandnervoussystemcomplications[J].VirolJ，2012，9：

8.

　　[17]WangCY，LiLuF，WuMH，etal.FatalcoxsackievirusA16infection[J].PediatrInfectDisJ，2004，23（3）：

275-276.

　　[18]井明艳，孙建义.蛋白质的折叠调控与包涵体的形成[J].浙江大学学报，2004，30（6）：

690-697.

　　（收稿日期：

2014-03-13）