雪霸国家公园珍贵原生植物之育种研究国立台湾大学.docx
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雪霸国家公园珍贵原生植物之育种研究国立台湾大学
雪霸國家公園珍貴原生植物之育種研究—
棣慕華鳳仙花物候調查及族群遺傳分子親緣的研究
內政部營建署雪霸國家公園管理處委託研究報告
中華民國九十五年十二月
雪霸國家公園珍貴原生植物之育種研究—
棣慕華鳳仙花物候調查及族群遺傳分子親緣的研究
受委託單位：
國立中興大學
研究主持人：
劉思謙
協同主持人：
高孝偉
研究人員：
張家維、徐光明
內政部營建署雪霸國家公園管理處委託研究報告
中華民國九十五年十二月
目次
表次‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧I
圖次‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧II
摘要‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧III
一前言‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧1
二材料與方法‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧2
1.物候週期調查‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧2
2.棣慕華鳳仙花自我更新觀察‧‧‧‧‧‧‧‧‧2
3.棣慕華鳳仙花的族群面積及數量推估‧‧‧‧‧‧‧‧‧2
4.族群遺傳基因變異情形‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧2
三結果‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧4
四討論‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧6
五建議‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧7
六參考書目‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧19
表次
表1台灣產三種鳳仙花型態特徵‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧2
表2採集樣本點及採集資料‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧3
表3鳳仙花ITSsequences‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧5
表4Sequenceidentitymatrix以及Pairwisegeneticdistance‧‧9
表5不同採集地棣慕華鳳仙花ITS-1,5.8S,ITS-2的DNA序列特徵‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧9
圖次
圖1雪霸國家公園內棣慕華鳳仙花分布圖‧‧‧‧‧‧14
圖2雪霸國家公園範圍外棣慕華鳳仙花分布圖‧‧‧‧15
圖3核糖體rRNA基因間序列圖‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧16
圖4鳳仙花DNA序列圖‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧17
圖5不同採集地棣慕華鳳仙花的親緣關係圖‧‧‧18
圖6不同地點採集的棣慕華鳳仙花其DNA序列的網狀圖關係圖‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧19
圖7黃花、紫花及不同採集地的棣慕華鳳仙花的親緣立體網狀圖‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧20
圖8貝氏分析法（Bayesian）重建的鳳仙花分子親緣關係圖‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧21
摘要
棣慕華鳳仙花（ImpatiensdevoliiHung）為臺灣的特有種植物。
由於目前棲地全世界僅限於雪霸國家公園觀霧高海拔地區，根據IUCN認定稀有植物受威脅程度分類表標準，可將其歸為易受害（vulnerable），屬於小而且狹隘分佈的族群。
因此棣慕華鳳仙花被雪霸國家公園列為保育順序第一優先的植物。
為了進一步瞭解在雪霸國家公園地區隸慕華鳳仙花的遺傳多樣性，我們用核醣體基因轉錄間隔區（internaltranscribedspacer,ITS）的DNA序列為遺傳標誌，分析採於梅峰臺大試驗場、大鹿林道、石鹿古道、宜蘭翠峰湖等處的標本。
在19條DNA序列中共發現8種不同的haplotypes。
Haplotypesdiversity為0.725。
種內遺傳歧異度（p-distance）平均為0.4%。
由ITS所構築的親緣關係樹得知，棣慕華鳳仙花種內並沒有分化亞族群的現象。
由此結果推論在雪霸國家公園隸慕華鳳仙花種內仍然存在中度的遺傳變異，而且有隨分佈距離增大而有遺傳歧異度增加的趨勢。
分析主要產於亞洲的鳳仙花的種類支持隸慕華鳳仙花與產於雲南的I.purpurea親緣關係最近，而與黃花鳳仙花（I.tayemonii）及紫花鳳仙花（I.uniflowra）親緣關係很遠。
關鍵詞：
棣慕華鳳仙花、雪霸國家公園、觀霧、族群遺傳變異
ABSTRACT
ImpatiensdevoliiisanendemicspeciesinTaiwan.ItisavulnerablespeciesbasedonIUCNcriteria,becauseitsgeologicaldistributionisrestrictedtoShei-PaNationalPark,anarealessthan100squaremeters.Thus,ithasbeenregardedasthefistpriorityspeciesfortheconservationinShei-PaNationalparkofTaiwan.Basedonourdataofcensusandgeographicaldistributionin2005,weconcludedthatthepopulationofI.devoliiissteadilyexpandinginShei-PaNationalpark.TofurtherinferthegeneticdiversityofI.devoliinShei-PaNationalpark,weanalyzedtheinternaltranscribedspacers（ITS）geneofI.devoliifromdifferentsamplingsites.Intotal19sequences,8haplotypeswerefound.Thehaplotypediversitywas0.725.Theaverageintra-speciesdivergence（p-distance）was0.4%.TheresultssuggestedthattheexistenceofmoderategeneticdivergenceamongI.devoliiinShei-PaNationalPark.PhylogeneticanslysisrevealedthatI.devoliihasnotdifferentiatedintosubpopulationandI.devoliihastheclosestrelationshipwithI.purpurefromYuan,China.
Keywords:
Geneticdiversitry,haplotype,Impatiensdevolii,ITS,Shei-PaNationalPark
1、
前言
鳳仙花（Impatiens）屬於鳳仙花科（Balsaminaceae），種類繁多而且分佈廣泛，主要分布於歐亞大陸高海拔地區，熱帶非洲及馬達加斯加。
台灣原生的鳳仙花共有一屬三種，分別為棣慕華鳳仙花（ImpatiensdevoliiHung）、黃花鳳仙花（ImpatienstayemoniiHayata）及紫花鳳仙花（ImpatiensunifloraHayata）。
三者皆為臺灣特有種，其中棣慕華鳳仙花的棲地，在全世界中僅限於雪霸國家公園的觀霧高海拔地區，佔有面積小於100平方公里，屬於小而且狹隘分布的族群。
根據IUCN認定的稀有植物受威脅程度分類標準，將其歸類為易受害（vulnerable），因此棣慕華鳳仙花早已被雪霸國家公園列為第一優先的保育類植物。
雖然棣慕華鳳仙花在生態保育上如此珍貴，但卻缺乏其分子親緣及族群遺傳方面的相關研究。
因此無法確定棣慕華鳳仙花和黃花鳳仙花及紫花鳳仙花之間的親緣關係，也不知道棣慕華鳳仙花在雪霸公園觀霧地區是否因地理或其他生物因子而被分隔成許多亞族群，或者會因為族群局限於一個地區，而產生自交或遺傳歧異度減少的現象。
鳳仙花植物花型特殊，是相當不錯的園藝觀花植物，有學者推薦篩選台灣原生種進行推廣，而棣慕華鳳仙花僅分布於雪霸國家公園內幾處狹小範圍，又被視為易受害植物之一，民國87年曾估計植群數量僅約4,000～6000之間，對於其族群數量的多寡、分布範圍的增減、物候週期的變化、遺傳基因變異及培苗所需要條件，理應有更進一步的認識，故有此研究計畫的提出。
本研究用分子生物學的方法來探討雪霸國家公園的觀霧地區棣慕華鳳仙花的分子親緣關及其族群遺傳結構。
探討棣慕華鳳仙花是否因為侷限於狹小的地理區域使得自交情況嚴重，而喪失了遺傳多樣性。
是否有形成亞族群的情況。
希望將來可以針對其基因遺傳多樣性來建立更完善的保育計畫，例如保育基因歧異度大及遺傳結構特殊的亞族群，或者可以利用人為方式交配植株來避免自交導致歧異度降低的現象等。
核醣體基因轉錄間隔區（internaltranscribedspacer,ITS）的DNA序列（Fig.3），因為其序列短，複製及分析容易，而且在各物種間變異度大等優點，近年來常被用於鑑定藥材或者比較各物種之間的遺傳岐異度。
只要利用聚合酶連鎖反應（polymerasechainreaction,PCR）方法即可從少量的樣本中增幅出中DNA以做為親緣分析。
Yuanetal（2004）用ITS來分析鳳仙花科（Balsaminaceae）物種間的親緣關係。
為了便於與他們的結果比較，以及此段基因用聚合酶連鎖反應方法增幅很穩定，本研究仍以ITS片段做為遺傳標誌。
由於Yuanetal（2004）的研究中並未使用貝氏分析法（Huelesenbecketal.,2001,2002）重建演化樹。
而且他們的研究結果顯示棣慕華、黃花紫花鳳仙花的親緣關係很遠。
為了確認他們的結果，本研究重新分析用貝氏分析法重新分析Yuanetal（2004）主要分佈於亞洲的鳳仙花。
2、材料與方法
1.物候週期調查：
於觀霧地區選擇棣慕華鳳仙花、黃花鳳仙花、紫花鳳仙花不同生育地，觀察紀錄三種鳳仙花植物於各區、各階段生長的情形。
表1、台灣產三種鳳仙花型態特徵（資料來源:
台灣維管束植物簡誌）
IMPATIENS 鳳仙花屬
多年生草本植物。
葉鋸齒或鈍齒緣，有柄。
花單生或總狀；萼片3，中央者囊狀，形成距；花瓣3，兩翼瓣常2-3裂；雄蕊5，單體。
蒴果細長，受力時快速捲裂而彈出種子 。
台灣有3種。
台灣鳳仙花種名
辨識特徵
Impatiensdevolii Huang
棣慕華鳳仙花
葉橢圓至長橢圓形，長5-14cm，寬2-5cm，先端尾尖。
總狀花序3-6朵花。
花冠淡紫紅色（原始描述為黃色）；花距末端不裂；翼瓣2裂。
特產北部中海拔略陰濕處。
Impatienstayemonii Hayata
黃花鳳仙花
葉橢圓狀披針形，長4-10cm，寬可達5cm，先端漸尖。
花通常單生葉腋，黃色，裡面帶紅或粉紅色斑點；花距末端2裂；翼瓣2裂。
特產中、北部中高海拔潮濕處。
Impatiensuniflora Hayata
紫花鳳仙花
莖有翼。
葉面具剛毛，橢圓至披針狀橢圓形，長1-10cm，寬1-5cm，先端漸尖或尾尖。
花通常單生稀2朵腋生；花距末端2淺裂；翼瓣通常3裂。
特產中高海拔潮濕處或小山溝中。
2.棣慕華鳳仙花自我更新觀察：
二月起於野外尋覓可能有鳳仙花小苗發生處，特別注意種子萌發之形態、單位面積的小苗數目及最後開花株數存活成長情形。
3.棣慕華鳳仙花的族群面積及數量推估。
4.族群遺傳基因變異情形：
（1）.採樣
採樣點為雪霸國家公園附近觀霧一帶（Fig.1-2）。
由於今年雪霸國家許多地區發生山崩，道路中斷因此採樣困難。
野外的標本包括採石鹿古道、神木步道、大鹿林道及宜蘭翠峰湖附近的的棣慕華鳳仙花。
表2採集樣本點及採集資料。
（衛星座標x=TWD67x,y=TWD67y）
NO
Species
採集地
座標
採集時間
01
Impatiensdevolii
宜蘭縣大同鄉翠峰湖
x303660
y2710749
2004,7,25
02
Impatiensdevolii
臺大梅峯園藝試驗場
2005,4,14
03
Impatiensuniflower
神木步道五指山看板旁
2005,4,22
04
Impatiensdevolii
神木步道五指山看板旁
2005,4,22
05
Impatiensdevolii
石鹿古道
2005,7,29
06
Impatiensdevolii
石鹿古道
2005,7,29
07
Impatiensdevolii
石鹿古道
2005,7,29
08
Impatiensdevolii
臺大梅峯園藝試驗場網室
2005,8,9
09
Impatiensdevolii
臺大梅峯園藝試驗場網室
2005,8,9
10
Impatiensdevolii
臺大梅峯園藝試驗場網室
2005,8,9
11
Impatiensdevolii
臺大梅峯園藝試驗場網室
2005,8,9
12
Impatiensdevolii
臺大梅峯園藝試驗場昆蟲室旁
2005,8,9
13
Impatiensdevolii
臺大梅峯園藝試驗場昆蟲室旁
2005,8,9
14
Impatiensdevolii
臺大梅峯園藝試驗場燥花坊
2005,8,9
15
Impatiensuniflower
臺大梅峯
2005,8,9
16
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.265273,
y.2710439
2005,9,30
17
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.265252,
y.2710441
2005,9,30
18
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.265162,
y.2710498
2005,9,30
19
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.264293,
y.2710071
2005,9,30
20
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.264189,
y.2709962
2005,9,30
21
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.264073,
y.2709950
2005,9,30
22
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.263594,
y.2709694
2005,9,30
23
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.263389,
y.2709996
2005,9,30
24
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.263006,
y.2710073
2005,9,30
25
Impatiensdevolii
大鹿林道
X.262585,
y.2710158
2005,9,30
26
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.262658,
y.2710772
2005,9,30
27
Impatiensdevolii
大鹿林道
x.261354,
y.2711106
2005,9,30
28
Impatiensdevolii
觀霧
2005,10,14
29
Impatiensdevolii
觀霧
2005,10,14
30
Impatiensdevolii
觀霧
2005,10,14
31
Impatiensdevolii
觀霧
2005,10,14
（2）.DNA萃取
依照GenomicDNApurificationkit（Puregene）方法，將新鮮或者乾燥的棣慕華鳳仙花葉片，剪下長寬約0.5~1.5cm大小的葉片，並放入研磨器中搗碎，過程中加入lysissolution300μl，磨至葉片溶解，將之放到1.5ml的離心管中，置於65℃加熱器上約14-16小時，接著置於冰上1分鐘，加入proteinprecipitationsolution100μl，vortex20秒，置於4℃冰上15~60分鐘，離心13000×g3分鐘，加入isopropanol400μlvortex均勻，置於冰上10分鐘，離心13000×g5分鐘，去除上清液，留下DNA沉澱，加入70%ethanol300μl，離心13000×g5分鐘，去除上清液，風乾5至10分鐘去除水氣，最後加入50μl的DNAhydrationsolution，保存於-20℃。
（3）.PCR增幅
選定5.8SribosomalRNAgene中的internaltranscribedspacer（ITS）為geneticmarker，合成一對ITS-1,ITS-4primers（Whiteetal.,1990）。
PCR的主要步驟為，在100μl的反應中，加入1unit的Taqpolymerase，10μl的buffer，適量的萃取DNA（CrudeDNA），4μl的dNTP，及所夾片段兩端的primer各1μl，最後加滅菌水至100μl。
將配好的溶液置於PCRmachine中，先94℃加熱4分鐘，而後熱循環定為94℃1分鐘，52℃1分鐘，72℃50秒共40個cycle，最後於72℃10分鐘後結束於4℃。
（4）.PCR產物純化
將PCR產物移到新的1.5ml離心管，依照Micro-EluteDNAClean/ExtractionKit的方法，加入同體積的bindingsolution，重新懸浮silicamatrix至均勻，並加入10μlsilicamatrix到PCR產物的混合液中，置在RT下5分鐘，過程中vortex2~3次，接著離心13000×g1分鐘，保留20μl溶液，去除剩餘上清液，將spinfilter放到collectiontube，將剛才20μl的溶液，重新懸浮後加入spinfilter中心，離心13000xg1分鐘，加入500μlwashsolution，再離心1分鐘，丟掉flow-through，風乾spinfilter上的酒精，最後加入15μlElutionsolution到spinfilter，離心1分鐘，將離心下去的溶液保存於-20℃。
（5）.DNA定序
純化的PCRfragment利用PCRmachine，在20μl的反應中，加入0.5unit的Taqpolymerase，8μl的Bigdye，適量的純化產物，並加入單方向的primer1μl，最後加滅菌水至20μl，放入94℃4分鐘後，和PCR方法類似的熱循環，96℃30秒，50℃10秒，55℃4分鐘，35個循環，最後72℃10分鐘後停於4℃。
在1.5mleppendrof中，加入95%的ethanol50μl，2μ的3MNaOAc（pH4.6）以及剛剛的PCR產物，混合均勻，置於冰上20~25分鐘，離心13000xg25分鐘，去除上清液，加入250μl的70%ethanol，vortex2~3秒，離心13000xg10分鐘，去除上清液，最後以speedvacuum抽乾，存放於-20℃，等到待測時進一步重新溶解並利用儀器定序。
（6）.資料分析
從NCBI將棣慕華鳳仙花ITS序列下載，並將紫花及黃花鳳仙花做為外族群，利用軟體Bioedit將我們定序的DNA及網路上下載的DNA做比對及整理。
用ClustalW（Thompsonetal.,1994）軟體排序。
配合DAMBE（XiaandXie,2001）、MEGA3.1（Kumaretal.,2004）做出差異度和相似度的比較。
用Modeltest軟體（PosadaandCrandall,1998）選擇符合DNA序列最適當的Model。
演化樹用最大似然率（Maximumlikelihood）。
我們使用MrBayes軟體（HuelsenbeckandRonquist,2001）及最小演化法（Minimumevolution）。
在族群分析上,使用Dnasp軟體（RozasandRozas.1999），配合Network（Bandeltetal.,1995,1999）軟體以及Spectronet（Huberetal.,2002）軟體做出其族群岐異度比較。
雖然Yuanetal（2004）已用ITS重建鳳仙花的親緣關係，但是他們並未採用的貝氏分析法重建演化樹。
棣慕華、黃花、紫花鳳仙花與其它鳳仙花的關係也未解析。
了進一步驗證他們的結果，我們們從GenBank下載主要產於亞洲的鳳仙花的ITS序列（表3），重新用最大似然率中的貝氏分析法重建演化樹（Huelsenbecketal.,2001,2002）。
這是一種新的分析方法，已為重建演化樹最重要的方法之一（Huelsenbecketal.,2001,2002）。
表3.鳳仙花ITSsequences（由GenBank下載）
Accessionnumber
Species
Origin
AY348740
I.amphora
WHimalaya
AY348744
I.apsotis
Sichuan,China
AY348745
I.aquatilis
Yunnan,China
AY348750
I.barbata
Yunnan,China
AY348754
I.bicormuta
Yunnan,China
AY348756
I.brachycentra
CentralAsia
AY348759
I.capensis
Quebec,Canada
AY348760
I.chimiliensis
Yunnan,China
AY348762
I.chungtieness
Yunnan,China
AY348767
I.corchorifolia
Yunnan,China
AY348770
I.cyanantha
Yunnan,China
AY348771
I.cyathiflora
Yunnan,China
AY348773
I.delavayi
Yunnan,China
AY348774
I.desmantha
Yunnan,China
AY348775
I.devolii
Taiwan
AY348776
I.drepanophora
Yunnan,China
AY348777
I.eubotrya
Sumatra,Indonesia
AY348778
I.faberi
Sichuan,China
AY348779
I.fenghwaiana
Guangxi,China
AY348782
I.fissicornis
Shaanxi,China
AY348783
I.flanaganae
Africa
AY348784
I.forrestii
Yunnan,China
AY348788
I.glandulifera
Wes
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