分子遗传学实验指导.docx

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分子遗传学实验指导

实验一人类体细胞染色体标本制备与核型分析

MetaphaseChromosomePreparationandAnalysisofKaryotype

【实验目的】

1．熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。

2．熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。

【实验原理】

染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。

因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。

正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。

因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。

上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。

【实验用品】

1．采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。

2．RPMI1640液体培养基、小牛血清、肝素（500U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。

3．2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。

【实验步骤】

一．外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析

1.采血及接种培养

1.1在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。

1.2常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。

1.3在超净工作台中，预先将RPMI1640液体培养基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加25滴全血（6号针头），水平摇动混匀。

1.4置37℃恒温培养箱中培养72小时。

培养过程中每天水平摇动培养物1～2次，使血液均匀悬浮，再继续培养。

1.5终止培养前2～4小时，加入秋水仙素，使终浓度达到0.2μg/ml。

轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。

继续培养至72小时。

2．制片

2.1收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物，再将全部培养物吸入刻度离心管中。

2.21000rpm离心8分钟（注意先配平）。

2.3弃上清液，加入37℃预温的0.075mol/LKCl溶液8ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37℃恒温水浴箱低渗处理25分钟。

2.4加入1ml新配制的固定剂（甲醇：

冰乙酸=3：

1），用吸管小心吹打、混匀，1000rpm离心8分钟。

2.5弃上清液，加入8ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。

2.61000rpm离心8分钟。

2.7弃上清液，重复固定一次。

2.8弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。

2.9吸取少量细胞悬液，滴2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气干。

2.10将标本置Giemsa染液中，染色8分钟，水洗去浮色，气干。

2.11显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。

二．人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备与分析

1.G显带染色体标本制备

1.1常规制片后，将标本置70℃烤箱中干烤2小时，自然冷却。

1.2取2.5％胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45ml生理盐水，用1NHCl或1NNaOH及酚红调节胰酶溶液成紫红色（PH6.8～7.2），置37OC预温。

1.3将玻片标本放入胰酶溶液中处理25～45秒钟，不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀。

随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长。

1.4取出染色体玻片标本，置于37℃预温的生理盐水中，然后用蒸馏水冲洗玻片（或轻甩，除去多余的胰酶）。

1.5将玻片标本放入37℃预温的Giemsa染液中，染色5～10分钟。

1.6自来水冲洗，气干。

1.7显微镜观察。

【实验结果与分析】

一.常规染色体核型分析

1．根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置，将染色体分为七组。

A组染色体：

包括1～3号染色体。

长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。

B组染色体：

包括4～5号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。

C组染色体：

包括6～12号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。

D组染色体：

包括13～15号染色体，具有近端着丝粒和随体。

E组染色体：

包括16～18号染色体，16号染色体着丝粒在3/8处，17号和18号染色体着丝粒约在1/4处。

F组染色体：

包括19号和20号染色体，中央着丝粒。

G组染色体：

包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的，为近端着丝粒的染色体。

21号和22号染色体具有随体。

2．绘图：

绘出在显微镜下观察到的染色体。

二．G显带染色体标本分析

G带显示的正常人显带核型特征（见附图1.1、1.2、1.3）

A组染色体：

包括1～3号染色体。

长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。

1号染色体

短臂：

在320条带左右的分裂相上，近侧段有两条深带，第2条深带稍宽；在处理好的标本上，远侧段可显出34条浅染的深带。

此臂分为3个区，近侧的第1深带为2区1带，第2深带为3区1带。

长臂：

副缢痕紧贴着丝粒，染色深浅不一，其远侧为一宽的浅带，近中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第2条染色较浓。

此臂分为四个区，副缢痕远侧的浅带为2区1带，中段第2深带为3区1带，远侧段第1深带为4区1带。

2号染色体

短臂可见四条深带，中段的两条深带较靠近。

此臂分为2个区，中段两条深带之间的浅带为2区1带。

长臂：

有7条深带，第3和第4深带有时融合。

此臂分为3个区．第2和第3深带之间的浅带为2区1带，第4和第5深带之间的浅带为3区1带。

3号染色体

着丝粒区浓染

短臂：

在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深带，其中远侧的一条较窄，且着色较浅，这是区别3号染色体短臂的重要特征。

近侧段的深带可分为两条深带。

此臂分2个区，中段浅带为2区1带。

长臂：

一般在近侧和远侧段各有一条较宽的深带。

在显带好的标本上，近侧段的深带可分为两条深带，远侧段的深带可分为三条深带。

此臂分为2个区，中段浅带为2区1带。

B组染色体：

包括4～5号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。

4号染色体

短臂：

可见两条深带，近侧深带染色较浅，短臂只有一个区。

长臂：

可见均匀分布的四条深带，在显带较好的标本上，远侧段的两条深带可各自再分为两条较宽的深带。

此臂分为3个区，近侧段第1和第2深带之间的浅带为2区1带，远侧段的两条深带之间的浅带为3区1带。

5号染色体

短臂：

可见两条深带，其中远侧的深带宽而且色浓，短臂只有一个区。

长臂：

近侧段有两条深带，染色较浅，有时不明显；中段可见三条深带，染色较深，有时融合成一条宽的深带；远侧段可见二条深带，近末端的一条着色较浓。

此臂可分为3个区，中段第2深带为2区1带，中段深带与远侧段深带之间的宽阔的浅带为3区1带。

C组染色体：

包括6～12号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。

6号染色体

短臂：

中段有一条明显而宽阔的浅带，其中近侧段和远侧段各有一条深带，近侧深带紧贴着丝粒；在显带较好的标本上，远侧段的深带又可分为两条深带。

此臂分为2个区，中段的明显而宽阔的浅带为2区1带。

长臂：

可见五条深带，其中近侧的一条紧贴着丝粒，远侧段末端的一条深带着色较浅。

此臂分为2个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1带。

7号染色体

着丝粒浓染。

短臂：

有三条深带，中段深带着色较淡，有时不明显；远侧深带着色浓宽，状如”瓶盖”。

此臂分为2个区，远侧段的浅带为2区1带。

长臂：

有三条明显的深带，远侧近末端的一条深带着色较淡，第2和第3深带稍接近。

此臂分为3个区，近侧第1深带为2区二带，中段的第2深带为3区1带。

8号染色体

短臂：

有两条深带，中段有一条较明显的浅带，这是与10号染色体相区分的主要特征。

此臂分为2个区，中段的浅带为2区1带。

长臂：

可见三条分界不明显的深带，远侧段的深带着色较浓。

此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。

9号染色体

着丝粒浓染。

短臂：

近侧段和中段各有一条带，在显带较好的标本上，中段可见两条窄的深带，此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。

长臂：

可见明显的两条深带，副缢痕一般不着色，在有些标本上显现出特有狭长的颈部区。

此臂分为3个区，近侧的一条深带为2区1带，远出的一条深带为3区二带。

10号染色体

着丝粒浓染。

短臂：

近出段和中段各有一条深带，在有些标本的中段可见两条深带，但与8号染色体短行比较，其深带的分界不够清晰。

此臀只有一个区。

长臂：

可见明显的三条带，近侧的深带较明显，远侧的两条深带较靠近，这是与8号染色体相鉴别的主要特征。

此管分为2个区，近侧段的一条深带为2区1带。

11号染色体

短臂：

近中段可见两条靠的很近的较窄的深带．在显带较差的标本上，只能看见一条宽带。

此臂只有1个区。

长臂：

近侧有一条深带，紧贴着丝粒．远侧段可见一条明显的较宽的深带，这条深带与近侧的深带之间是一条宽阔的浅带，这是与12号染色体相鉴别的一个明显特征；在显带较好的标本上，远侧段的深带可分为两条较窄的深带，两深带之间有一条很窄的浅带，一般极难辨认，但它是一个分区的界标，在有些标本上近末端处还可见一条窄的淡色的深带。

此臂分为2个区，上述远侧两条深带之间的浅带为2区1带。

12号染色体

短臂：

中段可见一条深带。

此臂只有1个区。

长臂：

近侧有一条深带，紧贴着丝粒；中段有一条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带，但与11号染色体相比较这条浅带较窄，这是鉴别11号与12号染色体的一个主要特征；在显带好的标本上，中段较宽的深带可分为三条深带，其正中的一条着色较浓；在有些标本上，远侧段的近端还可见1～2条染色较淡的深带。

此行分为2个区，中段正中的深带为2区1带。

X染色体

其长度介于7号和8号染色体之间。

短臂：

中段有一条明显的深带，如竹节状。

在有些标本上，远侧段还可见一条窄的、着色淡的深带。

此臂分为2个区，中段的深带为2区1带。

长臂：

可见4～5条深带，近中部的一条深带最明显。

此臂分为2个区，近中段的深带2区1带。

D组染色体：

包括13～15号染色体，具有近端着丝粒和随体。

13号染色体

着丝粒浓染。

长臂：

可见4条深带，第1和第4带较窄，染色较淡。

第2和第3深带较宽，染色较浓，此臂分为3个区，第2深带为2区1带，第3深带为3区1带。

14号染色体

着丝粒浓染。

长臂：

近侧和远侧各有一条明显的深带，在处理好的标本上，中段尚可见一条较浅的深带。

此臂分为3个区，近侧深带为2区1带，远侧深带为3区1带。

15号染色体

着丝粒浓染。

长臂：

中段有一条明显的深带，染色较浓，有的标本上，近侧段可见l～2条淡染的深带。

此臂分为2个区，中段深带为2区1带。

E组染色体：

包括16～18号染色体，16号染色体着丝粒在3/8处，17号和18号染色体着丝粒约在1/4处。

16号染色体

短臂：

中段有一条深带，较好的标本上可见两条深带。

此臂只有1个区。

长臂：

中段和远侧各有一条深带，有时远侧段的一条不明显，副缢痕着色浓。

此臂分为2个区，中段深带为2区1带。

17号染色体

短臂：

有一条深带，紧贴着丝粒。

此臂只有1个区。

长臂：

远侧段可见一条深带，这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带。

此臂分为2个区，这条明显而宽的浅带为2区1带。

18号染色体

短臂：

有一条窄的深带。

此臂只有1个区。

长臂：

近侧和远侧各有一条明显的深带。

此臂分为2个区，两深带之间的浅带为2区1带。

F组染色体：

包括19号和20号染色体，中央着丝粒。

19号染色体

着丝粒及周围为深带，其余为浅带。

短臂和长臂均只有1个区。

20号染色体

着丝粒区浓染。

短臂：

有一条明显的深带。

此臂只有1个区。

长臂：

在中段和远侧段可见1—2条染色较浅的深带，有时全为浅带。

此管只有1个区。

G组染色体：

包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的，具近端着丝粒的染色体。

21号和22号染色体具有随体。

21号染色体

着丝粒区着色浅。

与22号染色体相比较，其长度比22号短。

其长臂近侧有一明显而宽的深带。

此臂分为2个区，其深带为2区1带。

22号染色体

着丝粒区染色浓。

与21号染色体相比较，其长度比21号长；在长臂上可见两条深带，近侧的一条着色较浓而且紧贴着丝粒，近中段的一条着色浅，在有的标本上不显现。

此臂只有1个区。

Y染色体

长度变化较大，有时整个长臂被染色成深带。

在染色较好的标本上，可见两条深带。

此臂只有1个区。

图1.1G显带染色体核型

图1.2G显带染色体核型分析

图1.3正常男性G显带染色体模式图

【注意的问题】

1．采血时不要加入太多的肝素，因为肝素含量过多时往往抑制淋巴细胞的转化。

2．培养过程中培养液逐渐变黄色，说明pH发生了较大变化，将不利于细胞生长，此时可加入适量灭菌的1.4%NaHCO3溶液调整，或再加入2～3ml培养液的办法来校正。

3．培养失败的原因，一般有下述几种：

①培养瓶及器材洗涤不符合要求；②配制溶液的双蒸水不符合要求；③PHA和培养液的质量有问题，或培养液pH不符合要求；④无菌操作不符合要求，发生污染；⑤淋巴细胞对PHA反应降低，致分裂相太少。

4．标本质量不佳的原因：

①秋水仙素的处理不当，如秋水仙素的浓度不够或处理时间不足，结果分裂相太少；如浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难于进行分析；②低渗处理不当，低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失；如果低渗处理不够，则染色体分散不佳，难以进行计数分析；③离心速度不合适，收集细胞时离心的速度太低易丢失细胞，如果低渗后离心速度过高，往往使分裂相过早破裂，完整的分裂相减少；④标本固定不充分，如固定液不新鲜，或甲醇、冰醋酸的质量不佳，结果染色体模糊，或残留胞浆痕迹，使背景不清；⑤玻片去污不彻底，冷冻不够，使细胞悬液不能均匀附着以致细胞大量丢失，或染色体分散不佳。

5．制备G显带染色体标本时，要严格控制胰酶消化时间，时间不足显不出带纹，时间过长，使染色体不规则或形成空泡状。

附录

一、试剂及配制：

1、RPMI1640培养液

RPMI164010.4g

肝素80mg

PHA182mg

胎牛血清100ml

抗菌素8万单位

NaHCO32g

双蒸水定容至1000ml。

抽滤除菌，分装，-200C保存待用。

2、低渗液（0.075MolKCl）

KCl2.794g

三蒸水500ml

3、固定液

甲醇（AR）：

冰醋酸（AR）=3：

1现用现配。

4、Giemsa染液

贮存液

Giemsa5g

纯甘油（AR）330ml

甲醇（AR）33ml

先将Giemsa粉剂溶于少量的甘油中，在研钵中充分研磨至无颗粒粘糊状，再将全部甘油加入，然后移至烧杯中，在55～60OC温箱中放置2小时，冷却后加入甲醇，充分搅拌均匀，在室温放置2～3周后过滤除去絮状物，储存在棕色瓶中，一般放置3周后使用效果更好。

使用液

磷酸缓冲液甲、乙各2.5ml，加45ml双蒸水，加Giemsa原液2.5ml。

5、2.5%胰蛋白酶原液

胰蛋白酶粉剂2.5g

生理盐水100ml

6、秋水仙素（10mg/ml，使用液100μg/ml）

秋水仙素1g

生理盐水100ml抽滤，4OC棕色瓶保存。

7、肝素（2500U/ml，使用浓度50U/ml）

肝素钠312.5mg

生理盐水100ml高压灭菌。

8、Hanks液（g/L）

NaCl8.00

KCl0.40

CaCl20.14

MgSO4•7H2O0.20

Na2HPO40.06

KH2PO40.06

NaHCO30.35

葡萄糖1.00

酚红0.02

二、记录和检查回报表

表1染色体病病例检查分析记录

送检材料：

检查目的：

送检时间：

编号：

送检者：

院科医生

患者姓名：

性别：

年龄：

临床检查摘要于临床初步诊断：

家系资料：

表2染色体检查记录

（记录内容：

显微镜号、标本号、座标、核型与异常特点）

100

表3染色体畸变分析记录

玻片号

性别号

座标

核型

畸变染色体特点

照片编号

讨论：

分析结果：

分析者：

年月日

表4核型分析

12345

6789101112X

131415161718

19202122Y

表5核型分析检查回报单

姓名

性别

年龄

送检材料

送检目的

时间

编号

送检者

院科医生

临床初

步诊断

细胞遗

传学检

查结果

（1）X染色质检查Y染色质检查

（2）核型分析

（3）皮肤文理特征

（4）家系分析

诊断

检查者签字

年月日

实验二X和Y染色质标本的制作与观察

XandYChromatinPreparationandObservation

【实验目的】

熟悉X染色质和Y染色质的形态特征及其检查方法

【实验原理】

正常女性核型为46，XX。

在间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即X染色质，这是女性细胞中一条X染色体随机Lyon化失活形成的。

这种失活保证了雌雄两性细胞中都只有一条有活性的染色体，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。

称为X染色体的剂量补偿（参考Lyon假说）。

正常男性核型为46，XY。

在男性间期细胞核中，可见位于细胞核边缘或核中央处有一极小的黄色荧光亮点，就是Y染色质（Y小体），大小约0.25～0.3μm。

是Y染色体长臂特异性着色而形成。

人的性别是由X和Y染色体决定的。

需要对人的性别进行鉴定时，除进行染色体核型分析和临床生殖器官的检查外，还可以通过细胞学方法，如检查期间体细胞（口腔上皮，皮肤，羊水和血细胞等）的核内染色质——X和Y染色质来鉴定。

【实验用品】

显微镜、荧光显微镜、乙醇（无水乙醇,95％,70％、50％），甲醇，冰醋酸，硫堇，1％结晶紫，1mol/LHCl。

二甲苯、香柏油、擦镜纸、盖玻片、载片、15ml刻度离心管、牙签、吸水纸、小镊子、碘酒、酒精棉球、采血针、3％醋酸溶液、pH6～6.5缓冲液、0.5％盐酸阿的平染液。

（注：

硫堇染液（工作液），①干液（硫堇）：

硫堇1g或2g溶于100mL50%乙醇中，溶解后过滤备用；②醋酸钠缓冲液：

醋酸钠·3H2O9.7g，巴比妥钠14.7g，溶于500mL蒸馏水中；③0.1mol／L盐酸；按①：

②：

③=40：

28：

32比例配成混合液，调pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。

）

【实验步骤】

一、X染色质的制备和观察

（一）取材

1.让受检者用水漱洗口腔数次，以尽量除去口腔内细菌或其它杂物。

2.用牙签钝头部或木质器具刮取口内侧面的口腔粘膜上皮，弃去第一次刮到的细胞。

3.同一部位连续刮取数次，将刮取物涮入装有生理盐水的离心管内。

（二）标本的制作

1.将细胞悬液的离心管进行离心（1500rpm）10分钟，去上清液，留下细胞团。

2.加入新配制的固定液（3份甲醇︰1份冰醋酸）8mL，混匀呈悬液。

固定30分钟。

3.离心（同上），去上清液，留下细胞团。

4.加入数滴（根据细胞多少而增减）固定液，充分混匀呈悬液。

5.滴一滴悬液至预先置冰盒中的干净载玻片上，晾干。

每份样本制片3—4张。

（三）染色

Klinger硫堇染色法

1.将玻片标本置入1mol/LHCl中，37℃条件下水解20分钟。

2.用蒸馏水充分冲洗、晾干。

3.硫堇染液中染色约15分钟。

4.蒸馏水冲洗、晾干。

硫堇染色的优点是只有细胞核清晰着色，胞浆不着色，因此细胞核背景清晰，利于对位于核膜边缘的X染色质的辨认。

结晶紫的染色法

1.固定后的玻片标本经过70％、50％酒精及蒸馏水（更换两次蒸馏水）各5分钟。

2.置入1％结晶紫溶液中染色5～8分钟。

大量制片时可用0.5％结晶紫染液，染色10～15分钟左右。

3.95％酒精中分化（快速地在酒精中沾5～8次）。

4.继续在无水乙醇中分化，间歇地用显微镜检查，直至标本中核结构的微细部分都很清楚为止（一般约1分钟）。

5.置入二甲苯中。

更换2次二甲苯，每次3分钟，以使标本透明。

6.树胶封片。

（四）观察

1.先在低倍镜（10倍镜）下观察，可见视野中有许多单个或成堆的口腔上皮细胞。

选择清楚而分散的细胞，移至视野中央，再换高倍镜仔细观察。

口腔上皮细胞为多边形的扁平状，细胞中央有一被染成深兰色的圆形或椭圆形的细胞核。

核周围均质部分为细胞质。

细胞的外表为一很难与细胞质相区别的薄膜即细胞膜。

2.40倍或油镜下检查100个“可计数细胞”，并计数具有X染色质的细胞数。

二、Y染色质的制片与观察

（一）制作标本

1.采血与涂片：

男同学用碘酒，酒精棉球常规消毒食指或耳垂后，用采血针点刺食指或尖或耳垂，挤出2～3滴血于一干净的底玻片中央，用牙签将血滴涂成较厚的一层血膜，直径约1.5cm，晾干。

2.固定：

加3％的醋酸溶液数滴于血膜上，静置15分钟，其间可换液一次，使红细胞溶解。

3.用pH6

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