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应用科学研究期刊,4（7）:

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（C）2008,INSInet出版

黑根毛霉产生纤维蛋白产量和特性（Cooney&Emerson）

UsamaF.AliandZ.M.Ibrahim

埃及开罗，AinShams大学，教育学院，生物科学系

摘要：

在当地黑根毛霉产生纤维蛋白酶的产量和特性广为研究。

这种霉只在屠宰或肉贩场地的土里面才有。

该霉产量最高的条件是在35℃，PH8.0，使用0.6（%W/V）牛血纤维蛋白和3.0（%W/V）glucose.纯化纤维蛋白霉要完全按照以下连续的步骤：

透析，acetone20%，SephadexG200凝胶过滤。

to13.93folds.在40℃和PH8.2时霉活性最高。

该霉在pH8.0–8.5时稳定性最高，并且在70℃耐热一小时。

关键词：

纤维蛋白酶，真菌,黑根毛霉，纯化

前言

纤维蛋白是一种外伤后的血块形成的蛋白质。

这是停止血液损耗所必需的。

在身体里由二十多种利于凝血的酶，然而只有一种能够破坏血块。

它是一种内生的畸形伸长的纤维蛋白酶，称为血纤维蛋白溶酶。

溶栓酶是一种细胞外β-溶血链球菌产生的金属酶，而且被用作一种有效且便宜的溶血药物，以防止心肌梗死（心脏病发作）和肺栓塞。

它是一种细胞溶解酶药物。

它会在心脏病发作后，特定地尽可能快的进入静脉，使血块溶解在心壁的动脉里。

这样就降低了对心肌的损害。

这种药物不推荐在使用四天后继续使用，无论如何不能作为实际用药，而且也可能会引起变态反应。

为此，这通常只用于人的第一次心脏病发作。

（Wikipedia,thefreeencyclopedia.htm）

纤维蛋白酶能够在多种食物中找到，例如日本纳豆，豆腐，韩国Chungkook-Jang酱，和可食用的蘑菇。

纤维蛋白酶已经从这些食物中提炼出来，并且它们的生理生化特性已经被描绘出来了。

发酵虾酱，一种流行的亚洲调味品，被指出具有强烈的纤维蛋白活性。

这些新奇的纤维蛋白酶起源于传统的亚洲食物对溶解血栓剂疗法是有用的。

从能够便利且有效地大量生产这些酶以后，它们将会对当下用于心脏病的昂贵的纤维蛋白酶提供帮助。

另外，这些酶在食品强化和保健食品上有着可观的前景，正如它们的效应能够有效地预防心血管疾病。

纤维蛋白酶在包括蛇，蚯蚓，细菌（链球菌生脓原，气单胞菌属水疗院，沙雷氏菌属E15,B.纳豆，B.amyloliquefacens,放射菌类和真菌类，镰刀酶，毛霉菌，蜜环菌）中被有选择地找到。

由于纤维蛋白酶在医学领域的重要性，我们在埃及扎加奇格的屠场及肉贩的土里面通过黑根毛菌研究纤维蛋白酶的提取和它的一些生理生化特性。

原料和方法

真菌：

为了这次研究，在埃及考斯风州，扎加奇格的屠宰场地里，三种真菌在其它真菌中分离出来。

它们被Domsch等人提取出来，和米曲霉，曲霉菌酱油和黑根毛霉切片一样。

这些酶在亚洲人的食品中被迅速的应用到食品以及食品伴侣工业。

在一段试验之后，最后的一种真菌被用来研究纤维蛋白酶的提取，并且阐明了其生理生化特性。

相关创始人：

UsamaF.AliandZ.M.Ibrahim埃及开罗，AinShams大学，教育学院，生物科学系

E-mail:

usamahamed@

培养基及条件：

基本培养基是改良的查氏培养基，由以下部分组成（g/l）：

酪蛋白，5；蔗糖，30；K2HPO4,1.0;MgSO4.7H2O,0.5;KCl,0.5;FeSO4.7H2O,0.01和1000ml蒸馏水。

为了凝固和做斜面，另外加琼脂20g/l。

培养基需要在高压蒸汽灭菌锅中以121°C灭菌20分钟，然后冷却至室温。

1ml事先准备好的经过7天培养的孢子悬液（100000spores/ml）作为接种物，在35℃接种培养7天，菌丝体被过滤出来。

纤维蛋白酶的活性和蛋白质含量在过滤液中是固定的。

培养温度（20-45℃），PH值（4-9），培养期（2-3天），纤维蛋白含量（0.1–1.8%W/V），不同的碳源（淀粉，蔗糖，葡萄糖，乳糖和麦芽糖）和不同的葡萄糖浓度对结果的影响得到了一定的研究。

蛋白水解酶试验：

反应混合物包括0.5ml1%的酪蛋白，血红蛋白或纤维蛋白悬浮液中的任一，在0.1Mtris-HCl（pH8.0）和5ml真菌滤出液，37℃培养30分钟。

反应结束时加入1.0ml0.15%三氯乙酸。

酪氨酸在纯滤出液中是一定的，测得的吸光率为570nm。

一单位纤维蛋白酶是在试验条件下，一分钟内释放1μmole酪氨酸。

蛋白质测定：

蛋白质的测定是利用牛的血清蛋白在280nm的紫外吸收作为标准的。

纤维蛋白酶的纯化：

纤维蛋白酶是在真菌滤出液冷冻干燥并于4℃保存后纯化出来的。

这种酶的蛋白质在20%丙酮中产生沉淀，而且溶解在0.05MTris-HCl（pH8.0）的最小体积的缓冲溶液中。

这种酶用同样的缓冲溶液于40℃透析24小时。

在交联葡聚糖G200（18cmx2cm）下，呈柱层色谱图，与50mMTris-HCl（pH8.0）缓冲液相平衡。

该蛋白质用相同的缓冲液以20ml/h5ml的一部分洗脱，萃取。

一部分用来分析蛋白质和纤维蛋白酶的活性，大多数活性较大的部分都结合起来。

冷冻干燥使凝固，然后和之前一样的方法透析。

高效部分被选择出来并进行再一次的透析，来排除Na+andCl-。

将酶冻干并保存于0℃以便更多的研究。

纯化的纤维蛋白酶的一些特性：

Ph的影响以及Ph的稳定性：

Ph在酶活性方面的测定是通过将0.5ml酶加入到0.5mlof0.1%纤维蛋白悬液中，在不同的Ph值（3.6–8.5）下，使用0.05MTris缓冲液，于37℃培养30分钟。

酪氨酸的释放同于之前的描述。

为了测定Ph的稳定性，反应混合物在40℃培养24小时，然后剩余的活性就被测出来了。

温度的影响和热稳定性：

这是通过在0.05MTris（HCl）缓冲液下，以各种不同的温度（30-80℃）培养该霉而完成的。

为了测定热稳定性，反应混合物在40—70℃范围内培养一小时，剩下的活性在35℃。

结果与讨论

纤维蛋白酶在降低血液粘稠方面起着非常重要的角色，它能够不断地防止动脉硬化和动脉粥样硬化。

因此，它们大部分被应用在食品加工中治疗心血管疾病，例如心脏病，动脉粥样硬化。

它们有许多来源，包括微生物。

再一次飞行试验中，三种真菌在改良的查氏培养基中包括酪蛋白作为碳源，在35℃培养7天，得以纯化。

滤出液被测出分解酪蛋白，血红蛋白和纤维蛋白。

结果如表1，黑根毛菌分解纤维蛋白的效力最大（确切的活性是2.30单位/mg蛋白质）。

因此，这种真菌被选作我们试验用的真菌。

试验表明，纤维蛋白酶（2.28单位/mg蛋白质）产量最高是在35℃（Fig.1）。

这些结果是Abdel-Fattahetal.获得的，发现来自尖孢镰刀菌的纤维蛋白酶制剂最适宜温度是37℃。

然而，CheolYooetal.发现，来自蜜环菌提取物的纤维蛋白酶在33℃活性最高，Ming-ZhongSunetal.发现，来自蛇毒的纤维蛋白酶最适宜的温度是33–41℃。

不同的Ph值（Fig2.）对最适宜活性的影响在Ph7.0给予处（2.29单位/mg蛋白质）。

这与Bello,etal.从毒液中提取的纤维蛋白酶获得的结果一致。

但是Sook-Youngetal.发现蜜环菌提取物最适宜Ph是6.0，

Table1:

Productionofcasienolytic,haemolyticandfibrinolyticenzymesbytheisolatedfungi.

Fig.1:

EffectofincubationtemperatureontheproductionoffibrinolyticenzymebyRhizomucormiehei

Fig.2:

EffectofpHvalueontheproductionoffibrinolyticenzymebyRhizomucormiehei

Fig.3:

EffectofincubationperiodontheproductionoffibrinolyticenzymebyRhizomucormiehei

Fig.4:

EffectofdifferentconcentrationsoffibrinontheproductionoffibrinolyticenzymebyRhizomucormiehei

然而Ming-ZhongSunetal.获得的最好的蛇毒中的纤维蛋白酶Ph是在7.5-8.3。

在另一方面，YongPengetal.说解淀粉芽孢杆菌中的纤维蛋白酶最佳的ph和温度是9.0和48℃。

试验真菌的纤维蛋白酶最高产量是培养6天，给与2.96单位mg-1蛋白质（Fig.3.）。

试验真菌产生纤维蛋白酶的最大活性浓度达到了纤维蛋白的0.6（%W/V）（Fig.4.）给与3.1单位mg-1蛋白质，

Table2:

PurificationstepsoffibrinolyticenzymeofRhizomucormiehei

Fig.5:

EffectofdifferentcarbonsourcesontheproductionoffibrinolyticenzymebyRhizomucormiehei

Fig.6:

EffectofdifferentconcentrationsofglucoseontheproductionoffibrinolyticenzymebyRhizomucormiehei

Fig.7:

GelfiltrationofthefibrinolyticenzymebyRhizomucormiehei

使用葡萄糖作为碳源给与3.16单位mg-1蛋白质（Fig.5）和3.26单位mg-1蛋白质，当葡萄糖浓度是3.0（%W/V）时（Fig.6.）。

结果见Table

（2）和Fig.（7），结果显示试验用真菌产生纤维蛋白酶是通过20%丙酮沉淀纯化，交联葡聚糖G200凝胶过滤，高达13.93层。

该酶最适宜活性是Ph8.2，温度45℃。

在Ph8.0-8.5，温度70℃一小时稳定。

讨论：

据我们了解，这是第一次从黑根毛菌中提取纤维蛋白酶，黑根毛菌可能是制药工业血块的阻挠者。

谢辞

作者深深地感谢埃及开罗，AinShams大学，教育学院，生物科学系，微生物学教授，Dr.AhmedAwadEl-Gindy的指导。

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