磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化.docx
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磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化
编号NO：
河北农业大学本科毕业论文
论文题目磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化
学生姓名赵永涛学号2009014010207成绩
学院农学院专业班级农学0902
指导教师姓名李喜焕指导教师职称副教授
材料目录：
1、任务书
（1）份
2、开题报告（含文献综述）
（1）份
3、指导教师评阅书
（1）份
4、答辩记录表
（1）份
5、论文正文
（1）份
6、其它材料
河北农业大学
本科毕业论文任务书
学院：
农学院
教师姓名：
李喜焕
职称：
副教授
二零一二年五月四日
专业名称
农学院，农学专业
论文
题目
磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化
题目
来源
来自科研项目，结合科研任务进行
目的意义：
磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，土壤磷含量的多少对作物产量有很大影响。
而磷素缺乏是我国乃至世界农业生产中限制作物产量的一个重要因子。
因此，发掘植物自身磷营养效率的遗传潜力，改良现有品种的磷营养性状，提高作物自身吸收磷的能力，是提高作物产量的一个重要途径。
由于磷在土壤中难以移动且易被固定，植物对土壤中磷的吸收主要靠磷向根的迁移或扩散。
但磷在土壤中的扩散系数很低，植物根系只能吸收距根表面1～4mm土壤中的磷。
研究表明，作物在低磷胁迫下表现出各种适应机制，酸性磷酸酶（Apase）是植物体内比较重要的酶类之一，主要存在于植物根的表皮或叶的下表面，或由根分泌到外部的介质中。
它可以水解植物体内磷脂类化合物，使磷重复利用。
缺磷愈严重，其活性越高，磷重复利用越快，这是植物适应低磷逆境的一种表现。
本研究从根系形态及其根系分泌的酸性磷酸酶活性来探讨不同大豆基因型耐低磷能力的表现，以及不同供磷水平对大豆酸性磷酸酶活性的影响，对研究大豆根系的酸性磷酸酶变化和磷效率的关系，以及克隆植物酸性磷酸酶基因提供材料。
可行性分析：
1.研究条件：
作物在低磷胁迫下表现出各种适应机制，酸性磷酸酶是植物体内比较重要的酶类之一，可以分解土壤或植株的有机态磷转为无机态，从而被作物吸收利用，使磷重复利用。
有关植物酸性磷酸酶和磷素利用效率分析在其他植物已有报道，因此本研究是可行的。
2.预期结果：
通过测定供试180多份大豆品种资源在低磷、适磷2种处理下的植株根系酸性磷酸酶活性，阐明根系酸性磷酸酶活性和磷素利用效率间的关系，同时筛选出酸性磷酸酶活性高的品种。
3.可能存在的问题:
为使试验结果更加精确，试验环境选在接近大田条件的温室内，由于供试品种数量多，可能会受到环境因素影响，例如：
光照，温度等。
这些因素都有可能会给试验带来偶然误差，对结果有一定程度的影响。
进度安排：
2012年5-6月：
查阅资料，设计试验内容，选择大豆品种。
2012年6-12月：
撰写课程论文，开展试验内容，完成试验内容。
2013年1-6月：
整理试验数据，完善试验内容，撰写毕业论文，准备答辩材料，进行毕业答辩。
专家意见：
论文选题针对性强，依据充分，设计合理，路线可行，进度安排合理，预期结果明确，同意按计划执行。
专家签字：
2012年5月10日
学院意见:
院长：
年月日
农学院农学专业
赵永涛学生：
现把2012-2013学年，第2学期的毕业论文安排下达给你，你本学期承担的毕业论文任务如下：
1、依据本任务书中论文题目、目的意义、可行性分析的内容完成开题报告。
2、按照开题报告的要求按期完成毕业论文各项工作的实施。
3、完成毕业论文的撰写。
4、完成毕业论文的答辩。
请按相关要求完成毕业论文任务。
教师签字：
2012年5月10日
河北农业大学
本科毕业论文开题报告
题目：
磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化
学院：
农学院
学生姓名：
赵永涛
专业：
农学
班级学号：
2009014010207
指导教师姓名：
李喜焕
指导教师职称：
副教授
二零一二年六月五日
学生姓名
赵永涛
专业班级
农学0902班
学号
2009014010207
指导教师
李喜焕
职称
副教授
所在学院
农学院
论文名称
磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化
选题依据：
理论依据：
磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，土壤磷含量的多少对作物产量有很大影响。
而磷素缺乏是我国乃至世界农业生产中限制作物产量的一个重要因子。
因此，发掘植物自身磷营养效率的遗传潜力，改良现有品种的磷营养性状，是提高作物产量的一个重要途径。
由于磷在土壤中难以移动且易被固定，植物对土壤中磷的吸收主要靠磷向根的迁移或扩散。
但磷在土壤中的扩散系数很低，植物根系只能吸收距根表面1～4mm土壤中的磷。
研究表明，作物在低磷胁迫下表现出各种适应机制，酸性磷酸酶是植物体内比较重要的酶类之一，主要存在于植物根的表皮或叶的下表面，或由根分泌到外部的介质中。
它可以水解植物体内磷脂类化合物，使磷重复利用。
缺磷愈严重，其活性越高，磷重复利用越快，这是植物适应低磷逆境的一种表现。
目的意义：
研究表明，磷胁迫能够显著提高植物体内的酸性磷酸酶活性，其活性增加是植物对缺磷胁迫的一种适应性反应。
Marschner等和George等研究表明，根系分泌酸性磷酸酶活性有利于土壤有机磷的利用和吸收。
本研究从根系形态及其根系分泌的酸性磷酸酶活性来探讨不同大豆基因型耐低磷能力的表现，以及不同供磷水平对大豆酸性磷酸酶活性的影响，对研究大豆根系酸性磷酸酶变化和磷效率的关系和克隆酸性磷酸酶基因提供材料。
文献综述：
磷是植物所必需的三大营养元素之一，占植物体干重的0.2%，具有重要的生理功能。
土壤缺磷是影响大豆产量的重要因素。
据统计，我国磷肥当季利用率只有15%~25%，若施肥不当还会造成环境污染。
同时，磷是核酸和生物膜的能量代谢和生物合成的重要底物之一，并在光合作用、呼吸作用及一系列酶的调节作用中起重要作用，是影响植物生长和新陈代谢的最重要的矿质元素之一。
然而缺磷是我国及世界农业生产中限制作物产量的一个重要因子。
据统计，全世界43%耕地面积缺磷，我国耕地约有1亿hm2，缺磷耕地约占6667万hm2，大约有2/3农田磷素短缺。
实际上土壤中的全磷含量很高，但由于土壤中钙、铁、铝及土壤粘粒的大量存在，土壤中能为植物所直接吸收利用的有效磷却很低，因此作物仍表现缺磷，这就是所谓的“遗传学缺乏”。
目前，发掘植物自身磷营养效率的遗传潜力，改良现有品种的磷营养性状，已成为提高磷肥利用率的一个研究热点，也是新的交叉学科植物营养遗传学中的一个重要领域。
土壤有机磷只有被磷酸酶水解后才能被植物吸收利用。
酸性磷酸酶是酸性土壤及植物体内存在的一种重要的水解酶，能够将有机磷矿化为无机磷后被植物利用。
由于在低磷胁迫下，酸性磷酸酶基因的表达加强，诱导体内代谢副通路形成，通过调节体内一系列生理和生化反应，发展了一套复杂的代谢系统。
因此，植物磷效率受到很多因素的影响。
Helal等研究表明，在缺磷条件下植物对有机磷的利用能力明显提高，主要是由于缺磷诱导了植物根系的酸性磷酸酶活性显著提高，从而促进了有机磷的转化，建议将根系分泌酸性磷酸酶活性的高低作为筛选磷高效型植物的一个重要指标。
关于在缺磷胁迫条件下的适应性反应，酸性磷酸酶活性显著提高的研究结果在玉米、花生、小麦、甜菜等作物中均有报道，然而，对于大豆根尖在低磷条件下酸性磷酸酶的活性变化的研究却不是很多。
因此，本研究采用盆栽方法，在低磷和高磷水平下，对现有的180多个大豆品种进行试验，测定大豆根部酸性磷酸酶的活性和可溶性蛋白的含量，探讨营养环境中磷素营养水平对大豆根尖酸性磷酸酶活性变化的影响，及不同基因型间的表现特征，为作物品种磷效率的遗传改良提供依据。
研究方法、内容：
本研究采用温室盆栽的方式，设置低磷和高磷两个不同的处理，每个处理设3次重复。
试验采用大小一致的花盆，盆中土壤选用无磷土壤并以1:
1比例掺河沙配成，并和大田土壤隔绝。
播种前浇水使土壤环境湿润，选取形态结构特征一致的大豆种子播种。
播种后适时加入营养液，其中营养液的配置方法按Hoagland大量元素和Aron8微量元素配置，播种后每三天浇一次营养液，其中低磷处理采用低磷营养液（2μM），高磷处理采用高磷营养液（1000μM），培养35天后，收获植株，测定不同供试材料根系的酸性磷酸酶的活性和可溶性蛋白含量。
酸性磷酸酶活性的测定：
酶液的提取：
取1cm根尖，称取0.1～0.3g放入冰浴研钵中，加入液氮迅速碾磨至糊状。
匀浆转入离心管中，加入0.1mol/L缓冲液（1mol/L冰醋酸溶液28.82mL和0.3mol/L醋酸钠溶液273.3mL，pH4.0）1.2mL混匀，暂时在冰箱-20℃保存。
取出离心管在4℃冰冻离心机14000r/min离心30min。
取10μL上清液，加入490μL酶反应液（0.1mol/L缓冲液和0.25mmol/L硝基苯磷酸二钠溶液，即底物缓冲液），30℃下黑暗反应30min，加入2mol/LNaOH溶液0.2mL终止酶促反应。
酶活性的测定：
吸取100μL加入酶标板检测孔内，设空白对照，p-NP标准浓度，在405nm波长下由酶标仪测定吸光值，即OD值。
可溶性蛋白含量的测定
采用考马斯亮兰G-250法测定。
吸取上清液0.1mL，加水稀释到0.2mL，加1mL考马斯亮兰G-250溶液，摇匀，放置5min后，在595nm下比色测定其OD值。
以牛血清蛋白作为蛋白质标准（BSA：
0μg/mL、20μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、140μg/mL、180μg/mL、200μg/mL）。
酶活性以单位时间内单位可溶性蛋白质内的酸性磷酸酶水解对硝基苯磷酸二钠（ρ-NPP）生成对硝基苯酚（p-NP）的量（μmol/μg．min）表示。
统计分析：
Excel计算平均值及标准差，DPSV7.05进行方差分析和相关性检验。
进度安排：
2012年5-6月：
查阅资料，设计试验内容，选择大豆品种。
2012年6-12月：
撰写课程论文，开展试验内容，完成试验内容。
2013年1-6月：
整理试验数据，完善试验内容，撰写毕业论文，准备答辩材料，进行毕业答辩。
指导教师意见：
论文以测定和分析大豆品种资源的酸性磷酸酶活性为题，立题依据较充分，具有一定的理论和实用价值。
试验方案设计合理，科学可行，进度安排合适，预期结果明确，同意开题，并进入下一阶段试验内容。
指导教师：
2012年6月5日
审核小组成员
姓名
职称
备注
姓名
职称
备注
刘立峰
教授
张艳
讲师
王省芬
教授
李文龙
讲师
李志坤
副教授
开题报告记录：
1.植物体内的磷酸酶有几种类型？
答：
植物体内的磷酸酶包括酸性磷酸酶、中性磷酸酶和碱性磷酸酶，其中以酸性磷酸酶具有更好地分解土壤中的有机磷化合物释放相应的无机磷，提高土壤有效磷素的功能。
2.目前是否已有酸性磷酸酶基因的克隆报道？
答：
目前已从多种植物中克隆获得酸性磷酸酶基因，如水稻、玉米、大豆、苜蓿等。
审核小组评语：
该论文以分析大豆根尖酸性磷酸酶活性为研究内容，选题依据比较充分，试验安排合理，研究方法可行，同意开题并进入下一阶段试验工作。
审核小组组长：
（签字）
2012年6月10日
学院意见：
院长：
年月日
河北农业大学本科毕业论文指导教师评阅书
学生姓名：
赵永涛 学 号：
2009014010207
专业班级：
农学0902班 所在学院：
农学院
论文题目：
磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化
指导教师评语：
（1、对学生基础理论、专业知识、独立工作能力及学风的评语；2、对论文选题意义、引用资料；实验结果及数据的准确性；论文的创新点及写作的规范性、逻辑性；论文的不足之处等进行详细说明）
赵永涛在本课题组开展毕业论文工作期间，能够遵守学校和学院的各项规章制度，较好的完成论文涉及研究任务，具有较扎实的基础理论和专业知识。
论文以分析评价180多份大豆品种资源的根系酸性磷酸酶活性为研究内容。
选题针对性较强，依据充分，具有一定的科学意义和使用价值。
试验设计安排合理，技术路线可行，工作量较大，符合本科毕业论文要求。
论文写作格式比较规范，文献参考得当，符合一般科技论文写作要求。
论文不足之处在于：
（1）文中讨论部分应着重讨论本研究和前人研究的异同和创新性。
（2）英文摘要尚需进一步的推敲斟酌。
（3）文中表格注意采用三线表。
成绩评定：
是否同意答辩：
指导教师（签名）：
2013年6月2日
河北农业大学
本科毕业论文答辩评分表
评分指标
分值
评价内容
得分
论文选题
10
选题有重要理论意义或实用价值。
立题依据充分。
文献引用
12
阅读、引用文献资料较广泛，较全面了解本领域学术动态，综合分析能力较强。
论文难度
及工作量
14
难度较大，工作量大。
论文成果
的创新性
12
有独到见解，有较大的创新性成果。
理论基础和科研能力
16
具有坚实的基础理论和系统的专门知识，具有较强的独立从事科研工作的能力，研究方法和技术体系得当。
写作能力
16
条理清楚，层次分明，说理透彻，文笔流畅，表格、绘图准确规范，中外文摘要简明扼要，语句通顺，语法正确，符合科技写作规范。
答辩报告
10
能简明扼要、重点突出地阐述论文或设计的主要内容，有新见解，结论明确；时间掌握恰当。
回答问题
10
思维敏捷，逻辑性强，准确流利地回答各种问题。
总分
100
注：
本表为答辩小组成员评分用表，评分标准参照《河北农业大学毕业论文质量评定参考标准》
河北农业大学
2013届本科毕业论文答辩记录表
所在学院：
农学院专业班级：
农学0902班时间：
2013年6月6日
学生姓名
赵永涛
学号
2009014010207
指导教师姓名
李喜焕
职称
副教授
毕业论文题目：
磷胁迫下大豆叶片酸性磷酸酶活性的变化
答辩小组成员
姓名
职称
成绩
姓名
职称
成绩
刘立峰
教授
李文龙
讲师
王省芬
教授
李志坤
副教授
张艳
讲师
答辩小组评语：
该论文以测定180多份大豆品种资源的根系酸性磷酸酶活性为主要内容。
论文的立题依据较充分，试验数据比较可靠，工作量较大。
论文写作格式比较规范，符合一般科技论文写作要求。
在论文答辩过程中重点突出，回答问题基本正确。
答辩小组组长：
（签字）
年月日
答辩成绩：
注：
本表和学生毕业论文（设计）一同在学院存档（必须用钢笔书写）
河北农业大学
本科毕业论文（设计）
题目：
磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化
学院：
农学院
专业班级：
农学0902班
学号：
2009014010207
学生姓名：
赵永涛
指导教师姓名：
李喜焕
指导教师职称：
副教授
二O一三年六月六日
磷胁迫下大豆根系酸性磷酸酶活性的变化
赵永涛
指导教师：
李喜焕
摘要：
本研究利用180余份大豆品种资源为试材，研究不同大豆基因型在不同磷处理下的根系酸性磷酸酶活性的变化，测定供试品种在低磷（2μM）和适磷（1000μM）2种磷素水平下的根尖酸性磷酸酶活性和可溶性蛋白含量。
结果发现，在低磷处理条件下，不同大豆基因型的根尖酸性磷酸酶活性差异达到极显著水平，而在适磷条件下，不同品种的根尖酸性磷酸酶活性则差异不显著。
同时，筛选出了高磷酸酶活性和低磷酸酶活性的品种，为研究大豆根系酸性磷酸酶活性和磷效率关系提供了参考。
关键词：
磷胁迫；大豆；根系，酸性磷酸酶活性
Studiesofrootacidphosphataseactivityofsoybeanunder
phosphorusstress
ZhaoYong-tao
Supervisor:
LiXi-huan
Abstract:
Inordertoresearchthechangesofrootacidphosphataseactivityindifferentsoybeangenotypeswithdifferentphosphorustreatments,thepaperused180soybeanvarietieswithpotexperimentunderlowphosphorus（2μM）andadequatephosphorus（1000μM）levels.Therootacidphosphataseactivityandleafsolubleproteincontentweremeasured.Theresultsshowedthattherootacidphosphataseactivitybetweendifferentsoybeangenotypesunderlowphosphorusconditionhasasignificantdifference,whileunderadequatephosphorustreatment,thedifferenceofrootacidphosphataseactivitybetweensoybeangenotypeshasnotasignificantdifference.Thenthehigherandlowerrootacidphosphatasesoybeanvarietieswereselectedwhichcanbeusedforfurtherstudy.
Keywords:
Phosphorusstress;Soybean;Root;Acidphosphataseactivity
磷是植物必需营养元素之一，占植物体干重的0.2%，具有重要的生理功能[1]。
土壤缺磷是影响大豆产量的重要因素。
据统计，我国磷肥当季利用率只有15%~25%，若施肥不当还会造成环境污染[2]。
同时，磷是核酸和生物膜的能量代谢和生物合成的重要底物之一，并在光合作用、呼吸作用及一系列酶的调节作用中起重要作用，是影响植物生长和新陈代谢的最重要的矿质元素之一。
然而缺磷是我国及世界农业生产中限制作物产量的一个重要因子，据统计，全世界43%耕地面积缺磷[3]，我国耕地约有1亿hm2，缺磷地约占6667万hm2，大约有2/3农田存在磷短缺问题。
实际上，土壤中的全磷量很高，但由于土壤中的钙、铁、铝及土壤粘粒的大量存在，土壤中能为植物所直接吸收利用的有效磷却很低，因此作物仍表现缺磷，这就是所谓的“遗传学缺乏”[4]。
目前，发掘植物自身磷营养效率遗传潜力，改良现有品种磷营养性状，已成为提高磷肥利用率的一个研究热点，也是新的交叉学科植物营养遗传学中的一个重要领域。
土壤有机磷只有被磷酸酶水解后才能被植物吸收利用。
酸性磷酸酶是酸性土壤及植物体内存在的一种重要的水解酶，能够将有机磷矿化为无机磷后被植物利用[5]。
由于在低磷胁迫下，酸性磷酸酶基因的表达加强，诱导体内代谢副通路形成，通过调节体内一系列生理和生化反应，发展了一套复杂的代谢系统。
因此，植物磷效率受到很多因素的影响。
Helal等[6]的研究表明，在缺磷条件下植物对有机磷的利用能力明显提高，主要是由于缺磷诱导了植物根系的酸性磷酸酶活性显著提高，从而促进了有机磷的转化，建议将根系分泌酸性磷酸酶活性高低作为筛选磷高效型植物的一个重要指标。
关于在缺磷胁迫条件下植物的适应性反应，酸性磷酸酶活性显著提高的研究结果在玉米［7］、花生［8］、小麦［9］、甜菜［10］等作物中均有报道，然而，对于大豆根尖在低磷条件下酸性磷酸酶活性变化的研究却不是很多。
因此，本研究采用盆栽方法，在低磷和适磷2种水平下，对现有的180余个大豆品种进行了研究，测定其根尖酸性磷酸酶的活性和可溶性蛋白的含量，为进一步探讨研究根尖酸性磷酸酶活性和磷素利用效率关系提供依据。
1材料和方法
1.1供试材料
本研究采用180多个大豆品种进行根尖酸性磷酸酶活性研究，由河北农业大学农学院大豆遗传育种课题组提供。
1.2大豆幼苗培养
采用棚内盆栽，并和土壤养分隔离的方式，设置2个不同的处理，每个处理设3次重复。
准备大小一致的花盆，盆中土壤选用无磷土壤和无磷河沙并以1:
1比例配成。
种植前浇水2次以使盆中土壤均匀湿润，播种时每盆选5粒大小基本一致的大豆种子播种，出苗后适时浇灌营养液，其中营养液的配置方法按Hoagland大量元素和Aron微量元素配置。
播种后每7天浇灌一次营养液，其中低磷处理采用2μM低磷营养液，适磷处理采用1000μM适磷营养液，培养35天后，收获植株，测定不同供试大豆品种根尖的酸性磷酸酶活性和可溶性蛋白含量。
1.3根尖酸性磷酸酶活性的测定
1.3.1酶液的提取
取1cm根尖称取0.1～0.3g放入冰浴研钵中，加入液氮迅速碾磨至糊状。
匀浆转入1.5mL离心管中，加入0.1mol/L缓冲液（1mol/L冰醋酸（HAc）溶液28.82mL和0.3mol/L醋酸钠（NaAc）溶液273.3mL，pH4.0）1.2mL混匀，暂时在冰箱-20℃保存。
取出转有样品的离心管在4℃冰冻离心机14000r/min离心30min。
取10μL上清液，加入490μL酶反应液（0.1mol/L缓冲液和0.25mmol/L硝基苯磷酸二钠（ρ-NPP）溶液，即底物缓冲液），30℃下黑暗反应30min，加入2mol/LNaOH溶液0.2mL终止酶促反应。
1.3.2酶活性的测定
吸取100μL酶液加入酶标板检测孔内，设空白对照，p-NP标准浓度（0.005μmol/孔、0.01μmol/孔、0.015μmol/孔、0.02μmol/孔和0.025μmol/孔），在405nm波长下由酶标仪测定吸光值，即OD值。
1.3.3可溶性蛋白含量的测定
采用考马斯亮兰G-250法测定。
吸取上述酶液的上清液0.1mL，加水稀释到0.2mL，加1mL考马斯亮兰G-250溶液，摇匀，放置5min后，在595nm下比色测定其OD值。
以牛血清蛋白作为蛋白质标准（BSA：
0μg/ml、20μg/ml、60μg/ml、100μg/ml、140μg/ml、180μg/ml、200μg/ml）。
酶活性以单位时间内单位可溶性蛋白质酸性磷酸酶水解对硝基苯磷酸二钠（ρ-NPP）生成对硝基苯酚（p-NP
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