浅论吡格列酮对脂多糖引起的体外培养大脑皮层神经元NO释放的影响.docx

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浅论吡格列酮对脂多糖引起的体外培养大脑皮层神经元NO释放的影响

浅论吡格列酮对脂多糖引起的体外培养大脑皮层神经元NO释放的影响

【摘要】目的探讨吡格列酮（pioglitazon,Pio）能抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）引起的培养大脑皮层神经元一氧化氮释放增加，并探讨其抑制作用信号转导机制。

方法以体外培养6～7d的乳鼠大脑皮层神经元为研究对象,建立脂多糖损伤和吡格列酮保护模型。

采用Griess法测定细胞培养上清液中NO含量。

结果脂多糖可导致神经细胞损伤，培养液中NO含量升高；吡格列酮可明显抑制脂多糖引起的NO含量的升高。

结论吡格列酮可明显拮抗脂多糖诱导的神经细胞损伤。

【关键词】吡格列酮；脂多糖；神经元；NO

Abstract：

ObjectiveToexploretheexpresseffectsofpioglitazon（Pio）onlipopolysaccharide-inducedNOproductiontoculturedcorticalneuronsandinvestigateitssignalingpathway.MethodsTheinflammatoryneurotoxicitymodelwasconstructedinprimarycorticalneuronsisolatedfromSprague-Dawleyrats6～7dneonateratsfollowingadoselipopolysaccharidetotheneuronsdirectly.ThecontentsofNOwasdetected.ResultsThecells,exposedtoLPS（10μg/mLfor8h）,showedcharateristicchangeofdamage,whichcouldberelievedbypioglitazon（1μmol/L）withcellsurvivalrateincrement.PioglitazonecouldblocktheincreaseofNOinducedbyLPS.ConclusionsPioglitazonecanpreventtheneuronsfromthedamageofLPSinflammatoryneurotoxicity.

Keywords:

pioglitazon;lipopolysaccharide;neurons;NO

近年来的研究已显示脑内炎症反应参与了阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）以及帕金森病（Parkinsonisease,PD）等神经元变性疾病的发病过程［1］。

脂多糖是一种以氨基苷为组成单位的磷脂，构成革兰阴性菌细胞壁成分，是一种强效的炎症反应诱导剂。

Heneka等研究表明布洛芬和吡格列酮可以通过激活过氧化物酶增殖物激活受体（peroxisomeproliferators-activatedreceptor,PPAR）γ受体减轻神经胶质细胞的炎症反应［2］。

XingB等研究指出，吡格列酮对抗脂多糖诱导的多巴胺能神经元损伤通过抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达和NO的产生［3］。

NO是体内广泛存在的一种细胞信使分子，具有生理性代偿和病理性神经毒双重作用。

本实验通过体外培养乳鼠皮层神经元细胞，经LPS刺激造成神经元损伤模型，观察吡格列酮是否能抑制LPS引起的神经元NO释放增加，同时探讨吡格列酮抑制NO释放的可能的信号转导机制。

1材料与方法

　药品和试剂

吡格列酮由Takeda公司提供（批号：

060901，纯度99%），用二甲基亚砜溶解。

二甲基亚砜、脂多糖、DMEM、F12、胰蛋白酶、L-多聚赖氨酸购于SIGMA公司；GW9662（货号：

CAY-70785-M001）、SP600125（货号：

JBS-INH-006-M002）购于厦门励远有限公司；一氧化氮检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所；胎牛血清、HEPES、马血清购于北京华美转导科技有限公司；临用前用DMEM稀释到所需浓度，其余试剂均为分析纯。

　大脑皮层神经元细胞原代培养

参照文献［4］,取出生24h内的SD大鼠乳鼠,75%酒精浸泡消毒，无菌条件下取出大脑皮层，置于培养基中，剔除血管和软脑膜，用培养基清洗1～2次。

将脑组织移入另一含培养基的容器中，然后剪成1mm3大小的组织块。

加入%胰蛋白酶溶液37℃消化10min,并不时轻轻吹打。

待大部分细胞分散后，即加入完全培养基终止消化。

200目筛网过滤,1000转离心10min,用含10%胎牛血清、10%马血清的完全培养基将细胞制成悬液,调整细胞密度,以5×105/mL接种在多聚赖氨酸处理过的培养板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

48h后加入含阿糖胞苷（终浓度为5mg/L）的维持培养基,抑制非神经细胞增殖。

以后每3天换液1次,培养7d后用于实验。

　药物处理

神经元细胞培养7d后，首先用终浓度为10μg/mL的LPS分别加入培养基中共同培养1、2、4、8、16、24、48h观察LPS对NO释放的时间变化规律；加吡格列酮组：

在培养基中加入终浓度为1μmol/L吡格列酮作用1h后加入LPS10μg/mL共同培养8h；阻断剂组：

在培养基中加入终浓度为5μmol/L的JNK通路的特异性阻断剂SP600125共同培养一小时后加入LPS10μg/mL再共同培养8h。

　指标检测

Griess法测定培养液中NO的含量［5］。

Griess法原理是根据NO2+与Griess试剂反应生成红色化合物，颜色深浅与体系中的NO3+/NO2+含量成正比，从而测定NO含量，是一种间接检测NO的方法。

以1mol·L-1亚硝酸钠溶液,配制终浓度分别为0、1、2、5、10、20、40、60、100μmol·L-1的亚硝酸钠液。

按50μL/孔，在96孔板中加入标准品和样品。

按50μL/孔，各孔中分别加入室温GriessReagentI和GriessReagentII。

于540nm处测吸光度值（OD540）。

以亚硝酸钠浓度（μmol·L-1）为横坐标,所测OD值为纵坐标,作出标准曲线,并求出回归方程及相关系数。

　统计学处理

实验结果采用均值±标准差表示，用软件包进行统计分析，采用方差分析及q检验进行统计学处理，以表示差异的显着性。

　　2实验结果

　脂多糖作用于原代培养的皮层神经元不同时间对培养液中NO含量的影响

神经元细胞培养7d后，加入终浓度为10μg/mL的LPS到培养基中共同培养1、2、4、8、16、24、48h，收集各个时间点的上清液检测NO的含量。

NO标准曲线回归方程：

Y=+（r=）。

由表1可知，LPS作用于皮层神经元不同时间后，NO含量均有明显变化。

LPS2h组与正常对照组经统计学处理，有显着性意义。

LPS作用8h，培养液中NO含量达高峰，然后逐渐下降，48h恢复到正常水平。

在神经元与星形胶质细胞混合培养模型中，同样加入终浓度为10μg/mL的LPS到培养基中作用4h，培养液中NO的含量较LPS作用于单纯神经细胞培养上清液中NO的含量增加更明显，分别为±和±，二者比较具有明显的统计学意义。

表1LPS作用于皮层神经元不同时间对培养液中NO含量的影响

　吡格列酮抑制LPS引起的皮层神经元培养液中NO含量的增加

由表1可以看出，加入LPS作用8h，使NO释放达高峰，因此，本实验选择了吡格列酮与LPS共同培养8h这个时间点，观察吡格列酮对LPS引起NO释放的抑制作用。

结果表明，吡格列酮（,1和10μmol/L）可剂量依赖性抑制LPS引起的NO释放增加,吡格列酮（10μmol/L）可使LPS引起的NO释放恢复到正常水平（表2）。

表2吡格列酮对LPS作用于皮层神经元培养液中NO含量的影响

　LPS引起的皮层神经元NO增加的信号转导机制

为了观察LPS引起的皮层神经元NO增加是否与JNK信号转导通路有关,我们观察了JNK特异性阻断剂SP600125对LPS引起的NO产生的影响,结果表明,在加入LPS前2h加入SP600125共同作用8h,可明显对抗LPS引起的神经元NO产生增加,说明LPS引起的神经元NO产生增加是通过JNK信号转导通路。

单独应用SP600125对正常神经元NO产生没有影响。

表3吡格列酮影响LPS作用于皮层神经元培养液中NO含量变化的作用机制

3讨论

一氧化氮是一种神经递质，在神经发育及衰老过程中有重要作用。

正常情况下，参与多种神经功能，但若合成和释放过多，则会诱发细胞毒作用，导致细胞损伤，加速神经元凋亡或死亡。

本实验通过体外培养皮层神经元细胞，经LPS刺激造成神经元损伤模型，结果显示LPS可引起培养神经元细胞上清液中NO含量明显增加，从而引起神经元细胞凋亡。

为了进一步研究起作用机制，我们选用了JNK通路的特异性阻断剂SP600125，其显着抑制JNK介导的c-Jun磷酸化，抑制IL-2、IFN-γ、TNF-α和COX2等基因的表达。

实验结果表明LPS引起的皮层神经元培养液中NO含量的增加可能是通过JNK信号转导通路。

噻唑烷二酮类（thiazolidinediones,TZDs）和非甾体类抗炎药（nonsteroidalanti-inflammatorydrugs,NSAIDs）是PPARγ主要的合成配体。

吡格列酮是TZDs类化合物的一种，其通过激活PPARγ受体抑制LPS引起的皮层神经元培养液中NO含量的增加。

Reilly等研究表明前列腺素和吡格列酮通过激活PPARγ受体抑制了NO的生成［6,7］。

本实验结果显示吡格列酮通过部分激活PPARγ受体抑制了NO的生成。

以上都说明吡格列酮可以拮抗脂多糖诱导的神经元细胞的损伤,其具体机制有待进一步研究证实。

【参考文献】

［1］MartinoG,FurlanR,BrambillaE,et　andimmunityinmultiplesclerosis:

thadualsignalhypothesis［J］.Neuroimmunol,2000,109:

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［2］HenekaMT,SastreM,Dumitrescu-OzimekL,etal.AcutetreatmentwiththePPARgammaagonistpioglitazoneandibuprofenreducesglialinflammationandAbeta1-42levelsinAPPV7171transgenicmice［J］.Brain,2005,128（6）:

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［3］BinXing,TaoXin,RandyLeeHunter,etal.Pioglitazoneinhibitionoflipopolysaccharide-inducednitricoxidesynthaseisassociatedwithalteredactivityofp38MAPkinaseandPI3K/Akt［J］.Neuroinflammation,2008,5:

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［4］CopaniAM,KohJY.CotmanCW1Beta-amyloidincreasesneuronalsusceptibilitytoinjurybyglucosedeprivation［J］.Neuroreport,1991,2:

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［5］张均田.现代药理实验方法［M］.北京:

北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998：

1225-1226.

［6］ReillyCM,OatesJC,CookJA,etal.InhibitionofmesangialcellnitricoxideinMRL/lprmicebyprostaglandinJ2andproliferatoractivationreceptor-gammaagonists［J］.Immunol,2000,164（3）:

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［7］ReillyCM,OatesJC,SudianJ,etal.Prostaglan-DinJ

（2）inhibitionofmesangialcelliNOSexpression［J］.ClinImmunol,2001,98（3）:

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