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诱导多能干细胞（iPS）的研究热点和潜在应用

NIH四月份宣布要从紧张的经费中拨款，筹建诱导多能干细胞（iPS，InducedPluripotentStemCells）中心。

最近NIH也许因为在招人，我比较密集地听了一些iPS相关的讲座，所以想稍微总结一下，给有生物背景的科学工作者增加一些印象。

细胞核转移技术诞生的多利羊曾经在中国掀起一阵“克隆”热。

iPS技术的诞生则大大地更进了一步，它直接证明，用四个转录因子就可以让终末分化的体细胞回到原初的多能干细胞状态。

iPS不仅在生物学理论上有突破，在伦理学上绕过了胚胎干细胞，在实际应用上它也具有非常大的潜力。

1CellBasedTherapy:

在异体细胞或者器官移植过程中，免疫排斥一直是个难题。

理论上自身的体细胞（比如皮肤细胞或者血液细胞）可以在体外重编排成iPS细胞，而iPS细胞具有多能性，它能分化成任何其它组织特异性的终末分化细胞（比如神经细胞）或者干细胞，这些细胞如果移植到自身体内，则基本上不会产生免疫排斥的问题。

通过移植功能性的细胞（或干细胞），有可能使组织的损伤得到修复更新。

比如一些退行性疾病，心脏病，脊柱损伤等就有可能得到治疗。

2iPS细胞治疗的一个好处是，一些有遗传缺陷的细胞可以在体外修复，然后重新植入体内来修复组织或者器官。

3DiseaseModeling:

在体内，胚胎初期的干细胞分化出三胚层，胚层再分化成各种各样的细胞。

在体外，多能干细胞能很大程度上重演这个过程。

以往研究一个疾病的成因，需要依赖老鼠的模型，而老鼠建模本身很困难，模型和实际的人的疾病也可能相差甚远。

直接用病人的的细胞在体外重编程为iPS细胞，然后让iPS细胞分化成相关的有疾病的细胞，用正常iPS细胞做对照，观察这个过程中病人的iPS有哪些缺陷，发生哪些变化，可以为了解这个疾病的发生提供新的工具。

除了体外观察以外，疾病相关的iPS植入没有免疫力的小鼠，还可以在体内观察这些变化。

4DrugScreening：

干细胞的一个特点是可以在体外无限增殖。

大规模药物筛选通常需要很多细胞，iPS细胞（以及它分化的细胞）是想要多少就可以提供多少。

另外疾病特异的iPS细胞本身就是筛药的目标。

比如来自spinalmuscularatrophy的iPS细胞可能因为某个蛋白的表达下降导致它分化成神经干细胞的能力下降，那么就可以筛选提高iPS这个蛋白表达水平的药物，看它能否rescue这个iPS的分化能力。

这个药物本身也许就能改善spinalmuscularatrophy[1]。

5PersonalizedMedicine。

如前所述，来自于自体的iPS细胞可以在体外无限增殖。

某些药物只针对某些人群有用，而对另外的人群不仅没有治疗作用而且有副作用。

iPS（以及它分化的细胞）就可以为药物的分型提供帮助。

另外，个人化的细胞治疗本身也应该属于PersonalizedMedicine范畴。

因为iPS具有非常广泛的而且在某些方面优于胚胎干细胞（ES，EmbryonicStemCells）的应用前景，有关这个技术本身的基础研究也在如火如荼地展开。

6iPS细胞多大程度上等同于ES细胞。

除了它们都表达一样的多能性的marker外，有人做过它们全基因组表达谱的比对。

iPS细胞和ES细胞的差异约等于两个不同的iPS细胞克隆的差异，证明iPS几乎与ES细胞相同。

而动物所周琪组利用iPS细胞培育出小鼠个体，则最终证明iPS细胞和ES细胞具有一样的多能性[2]。

7那么iPS细胞是不是完全和ES细胞一样呢？

也不是。

还是有少量基因表达不同，一些在基因组上表观遗传（epigenetic）的修饰有差别，分化成某个细胞系的能力也有强有弱。

iPS还带有原细胞的记忆，比如来自血液细胞的iPS，相比于来自于成纤维细胞的iPS，它就更容易重新分化成血液细胞[3]。

这些记忆可以通过持续传代培养，或者一些表观遗传相关的药物处理逐渐消失。

8iPS细胞的来源。

什么细胞最容易重编排成iPS？

要用iPS细胞修复受损的心脏细胞，是不是来源于心脏细胞的iPS更好用？

最近有报道取点血样就可以做成iPS，以后就不用动手术取皮肤组织什么的了[4]。

9iPS重编排的机理。

现在做各种细胞信号通路的，smallRNA的，转录因子的，表观遗传的，都从各个不同角度研究这个reprogramming的机理，还有iPS自我更新，增殖，分化的机理。

10提高诱导iPS的效率。

现有的诱导iPS的方法效率很低，且这四个转录因子一直过表达的话都有致癌嫌疑且可能会影响后续的分化能力。

Scripps研究所的丁胜实验室在这一方面处于领先地位。

他用功能性的蛋白质取代过表达的四个转录因子，也取得了成功。

蛋白质因为在诱导iPS后会慢慢降解，所以大大降低了致癌可能性[5]。

最好的办法还是用小分子来诱导。

小分子随时可以撤走，方便简易成本低。

现在两个转录因子加小分子就可以诱导iPS[6]，我预计不远的将来，四个转录因子都会被小分子取代，且诱导的效率会大大提高。

11iPS致癌性的原因。

iPS技术的发明者ShinyaYamanaka现在就在研究如何区分好的和不好的（致癌的）iPS细胞。

通过发现好坏的marker，用FACS分选纯的好iPS，致癌性有可能大大降低。

12Transdifferentiation。

分化的体细胞-iPS-分化的其它细胞的路线用时比较长，人们预计一种类型的细胞可能可以跳过多能干细胞这一环直接转分化成另一类型的细胞，这个设想已经实现。

13iPS细胞的分化。

做细胞治疗用到的可能是iPS细胞，iPS分化成的干细胞，也可能是功能性的终末分化细胞。

iPS在体外高效地分化成组织特异性的细胞在某些细胞系已经得到实现，比如会跳动的心脏细胞，会放电的神经细胞，但是还有很多细胞系没有实现。

筛选能促使、促进细胞分化的小分子，现在也是研究的重点。

同样的，这些小分子在体内可能就能够直接帮助缓解某些疾病。

iPS技术发明不是很久，它是生物学这么多年研究新出现的一个让人兴奋的热点，中国现在快速跟进抢占山头很有必要。

在不远的将来，我预计胰岛素依赖的糖尿病（通过iPS分化出能产生胰岛素的B-cell并作细胞移植），白血病（通过iPS/ES重建血液系统）有可能得到根治。

癌症治疗投资如此巨大，研究这么多年尚没有突破性的进展，如果iPS短期内能彻底攻克一两个现在看来比较容易的病症，那么iPS/ES的研究还会继续加温。

另外本人随机想到：

成体终末分化的细胞能逆分化成多能的（全能的）干细胞，为什么不能诱导出组织特异性的类似于成体干细胞的细胞？

比如用血液细胞诱导出血液干细胞，还有肌肉干细胞，皮肤干细胞，神经干细胞等等。

理论上这个部分逆分化应该比完全的逆分化更简单。

我预计，通过研究维持成体干细胞多能性的转录因子的研究，有可能在不远的将来会实现这个设想。

NIH了解干细胞基础的报告：

http:

//stemcells.nih.gov/info/2006report/

NIH最近有关iPS/ES讲座的免费视频：

http:

//videocast.nih.gov/summary.asp?

Live=9470

http:

//videocast.nih.gov/summary.asp?

Live=9447

http:

//videocast.nih.gov/summary.asp?

Live=9450

References:

1.Ebert,A.D.,Yu,J.,Rose,F.F.,Jr.,Mattis,V.B.,Lorson,C.L.,Thomson,J.A.,andSvendsen,C.N.（2009）.Inducedpluripotentstemcellsfromaspinalmuscularatrophypatient.Nature457,277-280.

2.Zhao,X.Y.,Li,W.,Lv,Z.,Liu,L.,Tong,M.,Hai,T.,Hao,J.,Guo,C.L.,Ma,Q.W.,Wang,L.,etal.（2009）.iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementation.Nature461,86-90.

3.Kim,K.,Doi,A.,Wen,B.,Ng,K.,Zhao,R.,Cahan,P.,Kim,J.,Aryee,M.J.,Ji,H.,Ehrlich,L.I.,etal.Epigeneticmemoryininducedpluripotentstemcells.Nature.

4.Staerk,J.,Dawlaty,M.M.,Gao,Q.,Maetzel,D.,Hanna,J.,Sommer,C.A.,Mostoslavsky,G.,andJaenisch,R.Reprogrammingofhumanperipheralbloodcellstoinducedpluripotentstemcells.Cellstemcell7,20-24.

5.Zhou,H.,Wu,S.,Joo,J.Y.,Zhu,S.,Han,D.W.,Lin,T.,Trauger,S.,Bien,G.,Yao,S.,Zhu,Y.,etal.（2009）.Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins.Cellstemcell4,381-384.

6.Shi,Y.,Do,J.T.,Desponts,C.,Hahm,H.S.,Scholer,H.R.,andDing,S.（2008）.Acombinedchemicalandgeneticapproachforthegenerationofinducedpluripotentstemcells.Cellstemcell2,525-528.

从骨科医生到诺贝尔奖-山中伸弥的研究历程

引言

山中伸弥（ShinyaYamanaka）获得诺奖已经有几天了，ShinyaYamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。

他的成功再一次提示，有相当多的科学突破是不可预测的。

从这种意义上讲，展示ShinyaYamanaka在研究过程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是值得我花一点时间的。

解析ShinyaYamanaka发现诱导干细胞（iPS）的来龙去脉比较简单，就是跟踪他顺次研究的基因:

ApoBEC1-Nat1-Fbx15，最后发现iPS。

有趣的是他在顺次研究这些基因的时候转了两次方向：

ApoB是血脂蛋白，研究它的编辑酶ApoBEC1是为了调节血脂，但是却发现ApoBEC1过表达的小鼠得了肝癌；为了研究致癌机理，他找到ApoBEC1的下游蛋白Nat1，Nat1的敲除导致小鼠在胚胎期死亡，以及胚胎干细胞在体外无法分化；于是他又开始研究起胚胎干细胞，找到许多胚胎干细胞特异表达的基因，其中之一是Fbx15，最后用Fbx15敲除鼠建立assay（筛选方法/系统），幸运地筛选出了iPS。

骨科医生到博士阶段

ShinyaYamanka念高中时迷上柔道，因为受伤经常上医院，他在爸爸的建议下随后考入国立神户大学医学部，准备以后做一名骨科医生。

大学毕业做临床实习期间，他发现自己对手术其实没有什么天分，别人做20分钟的手术他两个小时也未必完成；并且他觉得做医生再优秀也只能帮助少数的病人，而医学研究有成果的话通常可以帮助更多的病人，所以他的兴趣转向基础医学研究。

在大阪市立大学博士期间，Shinya的主要工作是研究血压调节的分子机理[1,2]。

在研究过程中，Shinya对小鼠基因敲除和转基因技术感到震惊，于是他在申请博士后位置的时候联系的都是利用这些技术的实验室。

博士后阶段-ApoBEC1

这位失败的骨科医生最后被加州GladstoneInstitute的ThomasInnerarity纳入门下。

Thomas实验室研究的是血脂调节，跟Shinya博士期间的工作有点关系。

Shinya的新课题是研究ApoBmRNA的编辑蛋白ApoBEC1。

ApoB是低密度脂蛋白的主要构成成分。

ApoBmRNA可以被编辑酶ApoBEC1脱氨提前终止翻译，形成两种不同大小的蛋白：

全长的ApoB100和大约一半长的ApoB48。

经过编辑的ApoB48在血浆中会被迅速清除。

Thomas预测，如果在肝脏中过表达ApoBEC1，那么血脂就可能降低；如果这个模型可行的话，也许未来通过基因疗法可以帮助一些肥胖病人降低血脂。

Shinya一周七天地勤奋工作，花了六个月做成了转基因鼠。

有一天早上，帮他维护小鼠的技术员告诉他：

Shinya，你的许多小鼠都怀孕了，可是小鼠是公的。

Shinya说你不是跟我开玩笑吧。

他到老鼠房一看，果真有很多公鼠看起来怀孕了。

他杀了其中几只，发现原来是小鼠得了肝癌，肝脏肿大撑大了肚皮。

ApoBEC1过表达后低密度脂蛋白是降低了，但是高密度脂蛋白却升高了，同时还得了肝癌，这买卖不合算啊。

Shinya在一次讲座中总结了其中的经验教训：

其一，科学是不可预测的；其二，不要尝试在病人身上做新基因的治疗；其三，也许最重要的是，不要相信导师的假说。

Thomas对结果不能符合预期很失望，但是这个预想之外的结果却引起了Shinya的好奇：

究竟是什么机理使小鼠得肿瘤的呢？

好在Thomas足够开明，他允许Shinya偏离实验室的主要方向，继续探索ApoBEC1的致癌机理。

可以想见，ApoBEC1过表达以后也可能会编辑ApoB之外的其它mRNA，找到这些mRNA也许可以解释ApoBEC1为什么能致癌。

由于已知ApoBEC1需识别底物mRNA的特异序列才能编辑，Shinya据此设计引物扩增，找到了ApoBEC1的一个新底物-抑制蛋白翻译的基因Nat1。

ApoBEC1过表达后，Nat1蛋白消失。

从逻辑上讲，如果编辑Nat1是导致ApoBEC1致癌的重要分子，那么Nat1敲除的小鼠也会长癌。

ShinyaYamanaka和他的导师ThomasInnerarity在GladstoneInstitute实验室.

基因敲除比起转基因要更加复杂，需要把构建的质粒原位整合到体外培养的胚胎干细胞中。

基因敲除技术不就是Shinya博士阶段做梦都想学的技术吗？

于是Shinya找到所里做基因敲除的专家，当时还是助理教授的RobertFarese，从他的助手HeatherMyers那里学了这项技术的每个细节，并成功地获得了Nat1敲除的杂合鼠。

HeatherMyers是Shinya的终生好友；Shinya发现iPS以后，也公开表达了对HeatherMyers的感激，因为是她告诉Shinya，胚胎干细胞不仅仅是做敲除小鼠的手段，其本身也可以是非常有趣的研究对象。

在Shinya兴致勃勃地继续追问Nat1的功能时，他的妻子带着女儿离开他回到了日本。

半年后他决定中断研究带着三只珍贵的Nat1杂合鼠，也跟随家人回国。

大阪的毛毛虫阶段-Nat1

凭借他在博士后期间发表的四篇高质量的一作论文，1996年Shinya在母校大阪市立大学找到了助理教授的职位，继续他的Nat1研究。

再一次地与预测出现偏差：

Nat1敲除后，纯合子小鼠在胚胎发育早期就死了，根本无法观察到成鼠是否得肿瘤。

Shinya进一步研究发现，敲除Nat1的胚胎干细胞在体外根本不能像正常干细胞一样分化。

此时他想起了HeatherMyers的话：

胚胎干细胞不仅是研究的工具，它本身也可以是非常有趣的研究对象。

他的关注点开始转移到胚胎干细胞上来。

在刚回大阪的头几年，Shinya由于刚起步，只能得到少量的研究资助，他不得不自己一个人养几百只小鼠，日子过得非常艰苦。

同时大阪市立大学医学院的基础研究很薄弱，周围的人不理解Shinya研究Nat1在胚胎干细胞中的功能有什么意义，总是劝说Shinya做一些更靠近医药临床方面的研究。

而Nat1的研究论文提交给杂志后一直被拒稿。

种种压力与不得志，Shinya因之得了一种病叫PAD（PostAmericaDepression，离开美国后的抑郁症；自创的玩笑话），几乎要放弃科研回锅做骨科医生。

在他最低谷的时候，有两件事情把他从PAD中挽救了回来。

其一是JamesThomson（俞君英的导师，2007年几乎与Shinya同时宣布做出了人的iPS）在1998年宣布从人的囊胚中采集并建立了胚胎干细胞系：

这些干细胞在体外培养几个月后还可以分化成不同胚层的细胞，比如肠上皮细胞，软骨细胞，神经上皮细胞等[6]。

这给了Shinya巨大的鼓舞，他开始更加坚信胚胎干细胞研究是有意义的，将来必然有一天会用于临床。

第二件事是条件更加优越的奈良先端科学技术研究生院看上了他的特长，招聘他去建立一个做基因敲除小鼠的facility，并给他提供了副教授的职位。

奈良的成蛹阶段-Fbx15

千辛万苦脱了几层皮后，Shinya终于拥有了自己独立的实验室。

第一次可以招帮手，好爽啊。

但是问题又来了：

研究生的生源是有限的，学生会倾向于选择资历更老条件更好的实验室，而不一定会选择刚起步的实验室；你想招但人家不来啊。

为了吸引学生到他实验室，Shinya冥思苦想了好一阵，提出了一个雄心勃勃的计划，声称实验室的远景目标是研究怎么从终末分化的成体细胞变回多能的干细胞。

当时科学界的主流是研究怎么把胚胎多能干细胞分化成各种不同组织的细胞，以期用这些分化的功能细胞取代受损的或者有疾病的组织细胞。

Shinya认为自己的实验室没有实力跟这些大牛竞争，那不如反其道而行之，研究怎么从分化的细胞逆转为多能干细胞。

当时科学界的主流观点认为，哺乳动物胚胎发育过程中的细胞分化是单向的，就像是时间不可逆转。

这个观点也并非没有破绽，比如植物组织就具有多能性，一些植物的茎插入土壤会重新长出一棵植株，也即已经分化的茎细胞可以改变命运分化出新的根茎叶细胞。

而早在1962年，也即Shinya出生的那一年，英国的JohnGurdon爵士（与Shinya共享诺贝尔奖）报道了他的惊人发现：

把蝌蚪的肠细胞核移植到去核的蛙卵中，新细胞可以发育成蝌蚪。

如果把杂合细胞发育到囊胚期，用囊胚期的细胞核再做一次核移植，那么就可以发育出可生育传代的成蛙。

进一步地，为了说服人们接受终末分化的细胞核也具有多能性，他把成蛙不同组织的细胞进行体外培养，发现核移植后来源不同的杂合细胞都可以发育到蝌蚪阶段[9]。

1997年，IanWilmut和KeithCampbell基于同样的原理，把羊的乳腺细胞核移植到去核的羊卵中，成功地培育出了克隆羊多莉[10]。

2001年，科学家发现，通过与干细胞融合，胸腺细胞核获得了很大程度的重编程[11]。

Shinya计划的第一步是找到尽可能多的，类似于Nat1参与维持干细胞功能的因子（维持因子的意思是这些因子是胚胎干细胞在体外培养维持多能性所必需的）。

他大胆推测，如果过表达这些维持因子也许可以让终末分化的细胞变回多能干细胞。

一旦成功，诱导的多能干细胞会有着胚胎干细胞所不具备的优势：

它不仅可以绕开胚胎干细胞引起的伦理问题，病人本身的诱导干细胞改造后重新植入病人时，由于是自身的细胞，将不会有免疫排斥的难题。

在这个远大前景的感召下，Shinya果然“忽悠”了三个学生加入他实验室。

很快地，他们鉴定出一系列的在胚胎干细胞特异表达的基因。

其中一个基因就是Fbx15。

Shinya的学生YoshimiTokuzawa发现Fbx15除了特异表达于胚胎干细胞外，它还能被另外两个胚胎干细胞维持因子Oct3/4和Sox2直接调控。

Shinya跟Yoshimi说：

Fbx15应该参与维持干细胞多能性和胚胎的发育，我猜你没有办法得到Fbx15敲除的纯合鼠。

Yoshimi构建质粒做了基因敲除小鼠，把染色体上的Fbx15基因通过同源重组替换成抗G418药物的基因neo。

复杂的生命又一次愚弄了Shinya：

Fbx15敲除的纯合鼠活得很健康，没有显见的表型。

Shinya又挑战他的学生说：

好吧，Fbx15也许不是小鼠胚胎发育所必需的，但是它应该是维持体外胚胎干细胞所必需的，我打赌你没有办法在胚胎干细胞中彻底敲除这个基因。

勤快的Yoshimi于是用较高浓度的G418从干细胞中筛到了纯合的敲除株，还是活得好好的，没有表型[12]。

Shinya后来在回忆的时候打趣道：

小鼠很happy，细胞也很happy，唯一不happy的就是可怜的学生Yoshimi了。

但是花这么多精力做的敲除小鼠不能就这么算了吧。

Shinya又一次开动脑筋，想要废物利用。

他发现由于Fbx15只在胚胎干细胞表达，Fbx15promoter操控的抗药基因neo在成体的成纤维细胞里不表达，所以细胞对药物G418敏感；而敲除鼠里得到的胚胎干细胞却可以在很高浓度的G418中生长。

如果终末分化的成纤维细胞能诱导成胚胎干细胞，那么它就会产生对G418的抗药性。

即便成纤维细胞只是获得了部分胚胎干细胞的特性，那么它也应该能抗低浓度的G418（图二）。

Fbx15敲除鼠实际上提供了很好的筛选诱导干细胞的系统！

京都大学的化蛹成蝶阶段-iPS

凭借他鉴定胚胎干细胞维持因子的出色工作，2004年Shinya在名气更大的京都大学找到新的职位。

除了Fbx15敲除鼠的筛选系统，Shinya还积累了他鉴定的加上文献报道的24个维持因子。

Shinya跃跃欲试，他准备破壳而出，拍翅成蝶了！

Shinya的另一位学生KazutoshiTakahashi此前已经发表了一篇关于干细胞致癌性的Nature文章。

Shinya决意让他来承担最大胆的课题-逆分化成体细胞，因为他知道，有一篇Nature文章保底，即便接下来的几年一无所获，他的学生也能承受得了。

图二：

筛选iPS的系统。

在Fbx15敲除鼠基因组，Fbx15基因被βgeo基因（β-galactosidase和neo的融合基因）取代。

成鼠角形的成纤维细胞中，内源的Fbx15promoter关闭，βgeo不能表达，细胞在G418药物处理下会死亡；在圆形的多能干细胞中，Fbx15promoter会启动βgeo，细胞能在G418中生长。

如果成纤维细胞感染携带干细胞维持因子的逆转录病毒，并能够被逆分化成干细胞，那么它就能逃过G418的选择压力，增殖形成细胞克隆[13]。

即便有很好的筛选系统，这个课题在当初看来也是非常冒险甚至是不可行的。

当时的人们普遍认为成体细胞失去了多能性，也许成体细胞本身就是不可逆转的，你做什么也没有用。

即便通过转核技术实现了成体细胞核命运的逆转，那也只是细胞核，不是整个细胞。

胚胎细胞和成体细胞的染色体是一样的，细胞核具有全能性，尚可理解。

而且要实现细胞核的逆转还需要转到卵细胞，让卵细胞质帮助它重编程，而卵细胞质中的蛋白不计其数。

如果要实现整个细胞命运的逆转需要让细胞质中所有的蛋白重新洗牌。

即便细胞可以重新编程，那也应该是很多蛋白共同参与的。

Shinya当年在手上的仅仅是24个因子。

也许有另外几百几千种因子被遗漏，缺少其中一种都无法实现重编程。

用这24个因子异想天开要实现细胞重编程，根据已有的知识从逻辑上讲可能性几乎为零。

Kazutoshi这个愣头青不管这些，他给成纤维细胞一一感染过表达这些因子的病毒，结果当然没有筛选到任何抗G418的细胞。

Shinya知道如何保持学生的斗志，他故作镇定地说：

你