蛋白质电泳.docx

蛋白质电泳.docx

《蛋白质电泳.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质电泳.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

蛋白质电泳

DＮA电泳和蛋白质电泳有什么区别和联系

还有问题,就是既然驱动力是负电荷,那为什么移动的距离和分子量有关,而不是和所带的电荷大小有关呢？

还有为什么蛋白质电泳时垂直的,DNＡ电泳是水平的呢？

DNA电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳,电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。

蛋白质电泳（一般指ＳDS-PAＧE）一般使用的都是聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳的驱动力靠与蛋白质结合的ＳDS上所携带的负电荷。

所以相同点就是样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。

而且这两个电泳体系可以互相交换使用。

进行大分子蛋白质电泳时,可以考虑换用琼脂糖凝胶,因为该体系孔径大。

相反，如果需要精确到各位数碱基的DNＡ电泳也可以使用聚丙烯酰胺凝胶系统，因为使用该系统可以将相差一个碱基的两条DNA链分开。

不同点首先是样品不同。

这个就不用多说了。

其次是结果的观察方法不同。

DNＡ电泳普遍使用EB做染料,在紫外灯下观察；而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色，还需要经过脱色步骤，不过观察起来比较简单。

还有就是胶体系的差别,DNA电泳通常是一胶跑到底,而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。

先说这么多,有不明白的你再问好了~

回答补充:

电泳中样品移动的本质确实是样品所携带的电荷。

但是,区分这些条带直接可以用分子量而无需使用电荷数,是因为这些样品的电荷／分子量比都是恒定的了。

以DＮA分子为例，它在电泳中的移动是靠其骨架中磷酸所携带的负电荷来实现的,而这个磷酸分子又是每一个核苷酸中都有的,所以ＤＮA分子所携带的负电荷数是由其核苷酸总数决定的。

而且,DNＡ分子中核苷酸的组成动辄成百上千，在如此大的分子量面前，讨论单个核苷酸之间分子量的差别就显得毫无意义。

这样,ＤNＡ分子中负电荷的量就可以用DＮＡ的分子量来代替,反过来,DNA的分子量也就可以用DＮA分子所携带的电荷来代替（一句话,DNA分子的电荷/分子量比是恒定的）。

这在蛋白电泳中（特别是SDS-PAＧE中）是一样的。

在SＤS-PＡＧＥ中，ＳDS将蛋白质变性成直线分子并紧密包裹于其上,使得其所携带的电荷与蛋白分子量成了一定的比例,剩下的就和核酸电泳一样了。

至于为什么核酸的横着跑,蛋白竖着跑，个人认为最大的问题是蛋白制胶的过程导致的。

蛋白制胶由于使用了两种不同的凝胶系统,所以需要一个水平的分界面。

这个分界面在配胶的过程中是依靠异丙醇在重力作用下的压力下形成的。

所以,一并就竖着跑了～~

聚丙烯酰胺凝胶（ｐolyacrｙｌamidｅ　gel）是由单体（moｎomer）丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂（ｃｒｏsｓlinkeｒ）N，Ｎ’-甲叉双丙烯酰胺（N，N’－ｍetｈｙlenｅbisaｃryｌａmide,简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。

用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyａcｒyｌａmide　geｌelectrophorsis，简称PAＧE）。

聚丙烯酰胺凝胶用于电泳的支持介质,与其它凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶具有以下优点:

（1）孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，具有良好的分子筛效应。

根据待分离大分子的相对分子质量,通过改变凝胶浓度及交联剂度来调节凝胶的孔径，使大分子得到较好的分离。

（２）在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性,机械性能好

（3）凝胶是由—C—C—C—C—结合的酰胺类多聚物,侧链上具有不活泼的酰胺基，没有其它带电基团,所以凝胶性能稳定,电渗作用小，无吸附，化学惰性强。

与生物大分子不发生化学反应，电泳过程中不受温度、ｐＨ的变化的影响。

（4）具有高分辨率和灵敏度，尤其是在不连续电泳系统中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，样品不易扩散。

并有多种染色方法提高电泳条带显色的灵敏度,分离蛋白质的灵敏度可达10-6ｇ。

（5）单体纯度高，在相同的实验条件下,电泳结果具有很好的重复性。

（6）凝胶杂质少,在很多溶剂中不溶,可适用于少量样品的制备，不致污染样品。

以聚丙烯酰胺凝胶为支持物发展起来的电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDＳ-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、等电聚焦及双向电泳等电泳技术,不仅能分离、小量制备生物大分子,而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理 

聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。

琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。

琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从２00bp至近50kｂ的DNA段。

琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5－500ｂp）效果较好，其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。

聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。

聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。

目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

 琼脂糖凝胶电泳原理:

琼脂糖是从琼脂中提纯出来的,主要是由D-半乳糖和３，6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。

琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,通常使用的浓度是１%－３％,加热煮沸至溶液变为澄清,注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。

琼脂糖主要在DＮA制备电泳中作为一种固体支持基质。

琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。

琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。

尽管琼脂糖本身没有电荷,但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷,引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用,影响分离效果。

琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。

如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的,对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小,所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。

琼脂糖也适合于ＤNA、RNA分子的分离、分析，由于ＤＮA、RNＡ分子通常较大,所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。

例如对于双链DNA,电泳迁移率的大小主要与ＤＮＡ分子大小有关,而与碱基排列及组成无关。

另外,一些低熔点的琼脂糖在62 ℃时熔化,因此其中的样品（如DNA），可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间，重新溶解到溶液中而回收。

由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出,所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳,管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。

琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳,以及DＮA、RＮA的分析。

垂直式电泳应用得相对较少。

目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下:

（１） 琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

 （２） 琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大（约占98%～99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高，重复性好。

 （3） 琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

（４） 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。

制成干膜可长期保存。

 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAＧE（Polｙacrylａmiｄｅ gｅｌ ｅlｅctｒoｐhorｅsｉｓ）,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺

（CH2＝CHCONH2 Ａcrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（ＣH2（NHCOＨC＝ＣH2）2 N,N＇- methyleｎebisａcrｙlamide）聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。

常用的催化聚合方法有两种:

化学聚合和光聚合。

化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AＰ）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMＥＤ），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。

溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低 pH没有足够的碱基加速催化反应,同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。

所以制备凝胶时,在加过硫酸铵之前，混合物必须抽去空气。

核黄素催化的聚合作用,常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶孔度要大些。

核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使Ａcｒ发生聚合作用。

我跑电泳时,总会出现这样的情况:

目的条带没有，点样孔里倒是亮亮的.无论是跑ＤNA还是RNＡ都出现过这样的情况。

麻烦大家帮忙分析一下。

加样孔这个位置提供的是杂质残留的信息。

导致加样孔发亮的原因非常多,其中最主要的是非蛋白质/非核酸类的大分子杂质（如多糖、多酚）的残留以及蛋白质和核酸的同步残留。

大分子杂质的残留，首先与样品本身有关（如植物、菌、动物肝脏、肺等）,其次与所使用的方法/试剂去除这些杂质的能力有关。

蛋白质和核酸的同步残留,少量与样品有关　（如肌肉）,大部分则与所使用的方法／试剂,以及操作不当有关。

另外，样品使用过量,也是一个重要原因。

还有，加样孔不干净也有可能，但是可能性不大。

我是一个新手,请教一下为什么聚丙烯凝胶电泳中的浓缩胶可以把样压成一条线呢？

为什么浓缩胶和分离胶的电压不一样,浓度也不一样？

原理是什么?

多谢低浓度的凝胶具有较大的孔径,如３％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,可用于平板等电聚焦或SDＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶,也可以用于分离ＤＮA;高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中．

样品在电泳过程中首先通过浓缩胶,在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。

这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子,Cl－、甘氨酸阴离子以及蛋白质-SDＳ复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离,所以其电泳迁移率最小，而Ｃｌ-的电泳迁移率最大。

在电场的作用下，Cl-最初的迁移速度最快，这样在Cl-后面形成低离子浓度区域,即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度,因此Cl－后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。

达到稳定状态后,Cl-和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。

而蛋白质－ＳDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl-的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl－是快离子（前导离子）,甘氨酸是慢离子（尾随离子）。

当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH=8.8）较大，甘氨酸离解度加大,电泳迁移速度变大超过蛋白质－ＳDＳ复合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超过蛋白质-ＳDS复合物。

这时蛋白质-SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳,向正极移动。

由于蛋白质－SＤS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快;大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。

溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置。

sykes分析的很详细阿，偶真是受益匪浅阿！

以往只知道跑胶，对原理知之甚少，今天真是打开眼见阿。

以前也看过有关ＳDS－ＰＡGE的资料，但是没有讲的详细的。

请问这位大虾是从哪里弄来的啊?

多谢您了

电泳浓缩胶压缩原理

在不连续电泳中,样品在含有高于它的pＨ缓冲液中进行电泳。

此时样品以负离子形式存在，它在浓缩胶中（pH略低于样品）被高度浓缩呈薄层而实现提高分辨率的目的。

例如：

待分离样品是血清蛋白,浓缩胶用Ph6．7的Tｒis-HCｌBｕｆｆer　配制，电泳Bufｆer用ph8．3的Ｔrｉｓ-甘氨酸，配制。

电泳开始以后,我们待分离的样品蛋白在进入ｐH6．7的浓缩胶中，在电场和电泳Bｕffer的共同作用下解离成负离子向正极泳动。

同时电泳Bufｆer中的甘氨酸，因为其等电点为６.0所以在此过程中只有少部分解离（0.1-1%）成负离子向正极泳动。

同时浓缩胶中的ＨＣｌ解离度最大,几乎全部释放出氯离子向正极泳动。

根据电泳有效泳动率的公式；解离度（α）与泳动率（ｍ）的乘积等于有效泳动率（ｍα）。

在本次不连续电泳体系中，氯离子的有效泳动率最大称为快离子,甘氨酸电离出的负离子有效泳动率最小称为慢离子,而样品中的各种成分蛋白质的有效泳动率则介于快、慢离子之间。

因此在电泳开始的时候，快离子快速向正极泳动,慢离子和样品蛋白离子泳动滞后,因此在快离子后面形成一条离子浓度较低的低电导区域。

由于电导与电势梯度成反比，因此在此区域产生了较高的电势梯度,由于泳动率（m）与电势梯度呈正比,使得慢离子和样品离子根据其α的大小,有序的加速向快离子靠拢，最后在进入分离胶的时候形成我们通常见到的压缩现象。

所以，压缩现象不能形成的主要原因是:

一、缺乏快离子,浓缩胶中的Buｆfｅｒ失效。

二、缺乏慢离子，电泳Bufｆｅr的pＨ不适当。

三、电泳样品上样量过大,超过浓缩胶中Ｂufｆeｒ的缓冲容量。

SDS－PAGE电泳的原理及浓缩胶浓缩样品的原理（甘氨酸的作用）＠８/14/200９

实验台　

这是以前从网上下到的关于ＳDS-PAＧE电泳的讲解,个人觉得非常好,正好这几天有人问到这个东东，所以就拿出来贴到实验台里。

在此声明该内容为转载。

SＤＳ-ＰAＧE电泳的原理及浓缩胶浓缩样品的原理（甘氨酸的作用）

ＳDＳ-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。

下面就SDS－ＰＡGE的基本原理做简单介绍。

SDＳ－ＰAGE电泳的基本原理？

SDＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SＤＳ能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDＳ溶液中,与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SＤS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的ＳDＳ，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于ＳＤS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。

当分子量在15KD到２00KＤ之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式:

loｇMW＝Ｋ－bＸ,式中：

MＷ为分　子量,X为迁移率,k、ｂ均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDＳ-ＰAＧＥ电泳成功的关键是什么?

①溶液中SDS单体的浓度　ＳDＳ在水溶液中是以单体和SＤS－多肽胶束的混合形式存在,能与蛋白质分子结合的是单体。

为了保证蛋白质与ＳDS的充分结合,它们的重量比应该为1∶4　或1∶3。

②样品缓冲液的离子强度　因为SDＳ结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SＤＳ单体的浓度，不是总浓度,而只有在低离子强度的溶液中,SDS单体才具有较高的平衡浓度。

所以,ＳＤS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为1０-10０mM。

③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后,蛋白质分子才能被解聚,ＳDＳ才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。

Ｓａmｐｌｅbufｆeｒ中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。

前者有挥发性,最好使用前加入。

ＳDＳ-PAGE缓冲液系统的选择,Tｒis－Glｙcine、Trｉｓ-Triｃiｎe、Trｉs－硼酸盐或者其他?

一般来说,在被分析的蛋白质稳定的ｐH范围,凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。

Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。

如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统,对于分子质量小于15ｋDａ的蛋白样品,可以使用ＳDS-尿素系统，也可以采用Trｉs-trｉciｎｅ缓冲系统。

积层胶（或称浓缩胶）的作用原理?

在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在ｐＨ6.７时很少解离,其有效泳动速率很低,而氯离子却有很高的泳动速率，蛋白质的泳动速率介于两者之间。

加上电压以后,作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。

由于导电性和电场强度成反比,这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸离子的泳动，使其赶上氯离子,建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态（我不太明白这句话）,使这些带电颗粒以相同的速度泳动,两种离子之间有明显的边界。

当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度,界面后有一高电压梯度。

由于在移动界　面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低，因此氯离子能迅速越过。

移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中,其泳动速率比甘氨酸快。

因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，形成一条狭窄的区带。

蛋白质在移动界面中的浓度作用仅取决于样品和浓缩胶中Tris-HCl的浓度（为什么？

），而与样品中蛋白质的最初浓度无关。

由于浓缩胶为大孔凝胶，故对蛋白样品没有分子筛作用。

当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时,凝胶的pH明显增加，导致甘氨酸大量解离。

此时，甘氨酸的有效泳动速率明显增加,超越蛋白分子，直接在氯离子后移动。

由于凝胶孔径变小,蛋白质分子的迁移速率降低,落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和pH环境中泳动，并根据其固有的电荷与分子大小进行分离。

可见,甘氨酸并非作为缓冲成分参与，而是作为尾随离子来参与电泳过程。

以上内容主要摘自《蛋白质电泳实验技术》第二版（郭尧君编著）。

需要进一步了解相关内容的同学可以查阅该书。

SDS－pａge电泳小问答

　Q：

ＳDＳ-PＡGE电泳的基本原理?

A:

SＤS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SＤS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与ＳDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于ＳDＳ与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移　速度取决于分子大小。

当分子量在15ＫＤ到200ＫD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：

logMW=K-bX，式中:

MW为分子量，Ｘ为迁移率,k、ｂ均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

　　Q:

配胶缓冲液系统对电泳的影响？

A:

在SDＳ-PAGE不连续电　泳中，制胶缓冲液使用的是Trｉs－ＨCL缓冲系统，浓缩胶是ｐＨ6.７,分离胶pH8．9；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。

在浓缩胶中，　其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而ＣL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。

由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离,泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

Q：

样品如何处理？

　　Ａ：

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：

还原ＳDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SＤＳ处理。

　　1、还原SＤS处理：

在还原剂中加入ＳDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后,蛋白质构象被解离,电荷被中和，形成SＤS与蛋白相结合的分子,在电泳　中,只根据分子量来分离。

一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Ｂuffｅｒ,离心，沸水煮５min，再离心加样。

　２、带有烷基化作用的还原SDS处理:

碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护ＳＨ基团,得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。

100ul样品缓冲液中10ul２０％的碘乙酸胺，并在室温保温３0min。

　　3、非还原SＤS处理：

生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。

　Ｑ:

SＤS-ＰAGＥ电泳凝胶中各主要成分的作用?

　　Ａ:

聚丙烯酰胺的作用:

丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;

　制胶缓冲液:

浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择ｐＨ８．9，选择ｔｒis-HＣL系统,具体作用后面介绍；

TＥMED与AP:

促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固;

　十二烷基硫酸钠（SDS）：

阳离子去污剂,作用有四:

去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

　Q:

提高SＤＳ-PＡＧE电泳分辨率的途径？

　　A:

１、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。

建议做法:

待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。

忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。

一般凝胶可在室温下保存4天，ＳDS可水解聚丙烯酰胺。

2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-1０3。

　Q：

“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因?

　A：

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。

处理办法:

待其充分凝固再作后续实验。

　Q:

“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

Ａ:

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：

可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。

　Q：

为什么带出现拖尾现象？

　A:

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

　处理办法：

加样前离心；选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。

　Q:

为什么带出现纹理现象？

　Ａ：

主要是样品不溶性颗粒引起的。

　处理办法：

加样前离心；加适量样品促溶剂。

　　Q：

什么是“鬼带”,如何处理?

　　A：

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。

但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

　　处理办法:

在加热煮沸后，再添加适量的DＴＴ或Ｂeta巯基乙醇，以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

　Ｑ：

为