类似人类老年糖尿病大鼠模型之形态学变化.docx
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类似人类老年糖尿病大鼠模型之形态学变化
类似人类老年糖尿病大鼠模型之形态学变化
作者:
王晓宁高尤亮余文珍郑燕芳何才姑施红
【摘要】目的采用D半乳糖加高脂高糖乳剂及链脲佐菌素(STZ)构建类似老年人糖尿病的大鼠动物模型,观察其胰腺形态学变化。
方法选用健康Wistar雌性大鼠,20只灌胃生理盐水为正常对照组;20只采用腹腔注射D半乳糖40d为衰老模型组;另25只则采用腹腔注射D半乳糖40d并灌胃高脂高糖乳剂30d后腹腔注射STZ(体重≤200g按30mg/kg,体重>200g者按体表面积进行计算),制备衰老糖尿病模型大鼠,筛选空腹血糖≥11.1mmol/L者为成模鼠,上述各组大鼠再继续灌胃生理盐水10d后,各组随机取10个样本以免疫组化、光镜和电镜分别观察大鼠胰岛诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达、胰腺细胞凋亡、胰岛形态及胰岛细胞和腺泡细胞超微结构变化。
结果衰老模型组大鼠胰岛iNOS表达量和胰腺细胞凋亡数较正常对照组增加,衰老糖尿病模型组胰岛iNOS表达量和胰腺细胞凋亡数剧增达3倍以上。
HE染色显示,衰老模型组胰岛数量、面积仅为正常的50%~70%,衰老糖尿病模型组胰岛数量、面积仅为正常的20%~30%,且岛内中心部细胞(β细胞)消失尤为显著。
电镜观察显示,衰老糖尿病模型组大鼠胰腺细胞明显脱颗粒,呈现膜性结构皱缩,核染色质固缩、碎裂等细胞凋亡征象。
结论采用腹腔注射D半乳糖加高脂高糖乳剂及腹腔注射STZ,胰腺形态组织学证实大鼠在衰老模型基础上胰岛β、D细胞数量进一步下降可引发糖尿病。
【关键词】衰老;糖尿病;实验性/动物模型;D半乳糖;链脲佐菌素
【Abstract】ObjectiveToobservethevariancesinmorphologyoftheratmodelsimilartoagedhumandiabetesmellitus(DM).MethodsHealthyfemaleWistarratswerechosen.20ratswereintragastricadministratedwithphysiologicalsalinetobuildthenormalcontrolgroup;20ratswereintraperitonealinjectedwithDgalactosefor40daystosetuptheagedmodelgroup;and25ratswereintraperitonealinjectedwithDgalactosefor40days,intragastricadministratedwithenricheddietfor30dayssinceinjectionwithDgalactose11days,thenintraperitonealinjectedwithlowdosestreptozotocin(STZ)toconstructtheagedDMmodelgroup.Ratswhosefullbloodsugar(FBG)≥11.1mmol/LwerechosenassuccessfulagedDMrats.Afterintragastricadministratingallratswithphysiologicalsalinefor10days,10ratswereselectedfromeachgrouptodetectinducingnitricoxidesynthase(iNOS)expressioninpancreaticislandbyimmunohistochemistryABCmethod,detectpancreaticglandapoptosisbyTUNEL,andobservethechangeofhistmorphandultrastructureofpancreaticglandbylightmicroscopeandelectronmicroscope.ResultsContrastedwiththenormalcontrolgroup,theamountofiNOSexpressionofpancreaticislandandpancreaticglandapoptosisintheagedmodelgroupincreased.HEstainingmanifestedtheamountandareaofpancreaticislandintheagedmodelgroupwasonly50%~70%ofthatofthenormalcontrolgroup,andthedeprivationofcellsinthecenterofpancreaticislandwasespeciallypredominant.Theobservationofelectronmicroscopemanifestedthecellsofrats′pancreasintheagedDMmodelgroupobviouslydegranulated.ConclusionsTheadoptofintraperitonealinjectionwithDgalactose,intragastricadministrationwithenricheddiet,andthenintraperitonealinjectionwithSTZcanproducetheincreaseofapoptosisand/orcelldeathofiNOSandβcellinpancreaticisland,whichleadingtodegressionoffunctionandquantityofβcellinpancreaticisletandsuccessfullybuildingtheagedDMratsmodelwhichissimilartotheoldpeopleDMbest.
【Keywords】Theaged;Diabetesmellitus;Experiment/animalmodel;Dgalactose;Streptozotocin
随着人民群众生活水平的提高、老龄群体的扩大,老年糖尿病患病率亦随之大幅度增加〔1〕。
因此,建立一种稳定的类似老年人糖尿病特点的动物模型对于研究老年糖尿病具有重要意义。
本试验采用腹腔注射D半乳糖、给予高脂高糖乳剂30d后腹腔注射链脲佐菌素(STZ),在继血生化角度阐述该模型基础上,进一步从形态学角度论证该衰老糖尿病大鼠动物模型的可靠性和可信性。
1材料与方法
1.1材料3月龄Wistar雌性大鼠65只,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。
D半乳糖(上海试剂二厂),胆固醇(武汉亚法生物技术有限公司),胆酸钠(武汉亚法生物技术有限公司),链脲佐菌素(STZ)(由ALEXIS公司提供),诱导型一氧化氮合酶(iNOS)试剂盒,细胞凋亡试剂盒,均购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.2实验方法
1.2.1模型制备及分组正常对照组(A组):
大鼠腹腔注射生理盐水(1ml·100g-1·d-1)40d,同时给予自由饮水及普通饲料。
衰老模型组(B组):
参照《中药药理研究方法学》(人民卫生出版社,1994版),并参考有关文献〔2,3〕略加修改,将Wistar大鼠适应性喂养1w后,给予D半乳糖腹腔注射(50mg/kg体重,1ml/100g,1次/d),连续40d。
同时给予自由饮水及普通饲料。
衰老糖尿病模型组(简称衰老糖尿病组C组):
同上述衰老模型大鼠制作条件,同时从第11d起灌胃高脂高糖乳剂(10%胆固醇、20%猪油、2%胆酸钠和30%蔗糖的高脂高糖乳剂,冰箱保存,使用时先于37℃水浴中融化)每日上午1次,连续30d后,腹腔注射STZ(STZ现配现用,冰浴条件下,用pH4.2柠檬酸缓冲液配成0.25%溶液。
体重<200g者按30mg/kg体重,>200g者按体表面积进行计算)。
4d后,筛选禁食不禁水12h后血糖≥11.1mmol/L为衰老糖尿病成模鼠〔4〕。
其余饲养条件同正常对照组。
上述各组大鼠再继续灌胃生理盐水10d后,麻醉,取1/5胰腺组织保存于甲醛和Lille液中,行免疫组化、TUNEL、HE染色和电镜观察。
1.2.2观察方法一般状况观察:
包括大鼠饮水量、进食量、排尿量、精神状态、毛色及活动情况,每周测1次体重。
1.2.3指标检测
免疫组织化学法检测大鼠胰腺细胞凋亡、iNOS的表达
(1)免疫组织化学法(SABC)检测大鼠胰腺细胞凋亡、iNOS的表达〔4,5〕;
(2)结果判定采用DAB染色法:
①细胞核中呈现棕褐色颗粒者,为染色阳性的凋亡细胞;②胞浆棕黄染色者为iNOS阳性;(3)结果观察:
①凋亡细胞观察:
每例切片高倍视野(×400)下连续计数10个网格染色阳性的凋亡细胞数,作为胰腺组织凋亡细胞数。
②iNOS蛋白观察:
每例选1个胰岛,400倍镜下摄像,并采用形态学图像分析系统1.0计算胰岛正常染色的平均积分灰度值=∑(面积×平均灰度)/∑面积,iNOS蛋白表达的积分光密度A值=∑(面积×平均棕黄染色光密度A值)/∑面积。
光镜观察大鼠胰腺组织形态变化取胰腺,用10%甲醛液固定,常规石蜡包埋切片,HE染色。
每例选取一张切片,100倍光镜下,连续计数10个视野的胰岛数目并量取胰岛的长度、宽度,以计算胰岛总面积。
电镜观察大鼠胰腺组织超微结构变化取1mm3大小胰腺,经固定、漂洗后固定漂洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片、染色等步骤,在日立Hu12A型透射电镜下观察并摄片。
1.3统计学分析数据以x±s表示,方差齐者用t检验;方差不齐者用t′检验;采用SPSS11.5统计软件进行统计分析。
2结果
2.1一般状况观察正常对照组大鼠饮食饮水(进食量14g·只-1·d-1,饮水量42ml·只-1·d-1)及大小便、活动正常,4w(第2周末~第6周末)体重增加幅度为(56.4±10.5)g。
衰老模型组大鼠饮食饮水及大小便正常,活动较A组稍差,相应4w体重增加幅度为(49.5±11.4)g。
衰老糖尿病模型组高脂高糖乳剂灌胃30d后,饮食饮水增加明显(进食量25g·只-1·d-1,饮水量63ml·只-1·d-1),给予高脂高糖乳剂4w(第2周末~第6周末),体重增加幅度为(81.4±12.6)g;注射STZ后第4天,出现多尿、多饮(饮水量95ml·只-1·d-1),活动减少,体毛松散,精神萎靡,无死亡,5只大鼠血糖不合标准被剔除,成模率达80%。
2.2各组大鼠胰腺组织细胞形态学变化
2.2.1各组大鼠胰腺组织细胞凋亡数、胰岛iNOS表达变化由图1、表1可见,正常对照组胰岛呈团索状,境界清晰,岛内细胞呈圆型,胞浆丰富,核圆居中,胰岛周围腺泡细胞散在分布少量凋亡细胞,400倍镜下,平均凋亡细胞数为1~3个。
衰老模型组胰岛数量减少,胰岛边界尚清晰,岛外腺泡细胞可见到一定量凋亡细胞,400倍镜下平均7~12个。
衰老糖尿病模型组胰岛数量和面积明显减少,甚至较难找到,而胰岛周围腺泡细胞可见到大量凋亡细胞,400倍镜下,平均(23±8)个。
由图2可见,正常对照组胰岛内仅有少量细胞可见到胞浆浅淡色棕染的iNOS,彼此未融合。
衰老对照组胰岛内可见到较多胞浆棕染的iNOS,部分融合成片状;衰老模型组胰岛内可见到大量堆积融合成团块状的棕褐色深染的iNOS。
另外,对各组胰岛细胞iNOS积分光密度(A)值(代表iNOS相对量)分析:
与正常对照组比较,衰老对照组胰岛iNOS积分A值明显升高(P<0.01),衰老糖尿病模型组胰岛iNOS积分A值升高更明显;而且,胰岛iNOS积分A值与胰岛积分灰度值(为无iNOS染色的胰岛细胞相对量)比值所示,衰老对照组比值增加,为正常对照组1.5倍以上,衰老糖尿病模型组iNOS量增加量达正常对照组3倍以上。
表1各组大鼠胰腺组织凋亡细胞数及胰岛iNOS表达变化的影响与正常对照组比较:
1)P<0.05;与衰老模型组比较:
2)P<0.01;下表同
2.2.2光镜下大鼠胰腺组织形态学变化由图3、表2可见:
正常对照组胰岛呈团索状,境界清晰,胰岛细胞椭圆型,胞浆丰富,核圆居中,胰岛数量、面积及岛内细胞均匀分布;衰老对照组胰岛数量、面积下降(P<0.01),胰岛细胞边界尚清晰,细胞排列尚规则、整齐,细胞体积较正常缩小,致密度略增加;衰老糖尿病模型组胰岛数量、面积明显减少,岛内细胞尤其是中心部细胞明显空泡化、减少,甚至消失。
2.2.3大鼠胰腺组织超微结构变化由图4电镜观察可见,正常对照组大鼠胰岛细胞胞浆内富含带晕环的分泌颗粒,且颗粒饱满,细胞完整;衰老糖尿病大鼠胰岛细胞空泡变性,细浆内带晕环的分泌颗粒减少,内容物脱落,电子密度明显降低。
另外,正常对照组大鼠胰腺腺泡细胞核圆居基底中央,核膜清晰,核染色质及内容物分布均匀,细胞内线粒体、内质网排列紧密、整齐,有序分布于细胞基底部,内质网上所结合的基粒清晰、牢固,细胞顶部囊泡多、大、均匀且内容物丰富;衰老糖尿病大鼠胰腺腺泡细胞核膜皱缩、边界凹凸不平,核染色质固缩,细胞内胞浆被分隔,形成残余结构物,线粒体、内质网排列不规则,弥散分布于细胞,线粒体密度降低,嵴变短浅,内质网上基粒不清晰、脱落,细胞顶部囊泡减少,大小不一,密度不均匀或下降。
表2各组大鼠胰岛数目及其面积变化的影响(x±s,n=10) 3讨论
大量研究证实:
D半乳糖可使许多组织出现类似衰老的退行性改变,如与自然衰老相似的生化改变〔6〕,基因表达与调控异常,细胞生长繁殖能力下降及细胞退行性改变〔7〕。
因此,D半乳糖模型已成为国内外学者研究老年病常用的病理模型。
本课题组继前人和以往经验〔8〕,采用D半乳糖加灌胃高脂高糖乳剂加注射低剂量STZ制备衰老糖尿病模型大鼠的血生化指标显示:
衰老模型组和衰老糖尿病模型组大鼠血清丙二醛(MDA)含量明显升高,而超氧化物歧化酶(SOD)活性显著下降,且衰老模型大鼠已出现包括血糖、血脂、游离脂肪酸(FFA)、总胆固醇(TC)升高和高密度脂蛋白(HDL)的下降,而衰老糖尿病模型组尤突显以血糖、胰高血糖素、FFA、TC、三酰甘油(TG)、TNFα的升高,及胰岛素、GLP1的显著降低,其较正常对照组和衰老模型组均有显著性差异。
本实验发现,由iNOS催化生成的大量NO在胰岛β细胞凋亡中起重要作用。
已知,NO在体内具有双重性作用,其作用取决于生物体内NO的相对浓度〔9〕及环境中刺激因子的综合作用。
生理水平(pmol/fmol)的NO由原生型一氧化氮合酶(cNOS)催化生成,主要发挥细胞信息传递作用或诱导Src蛋白活化,可引发抗凋亡级联反应〔10〕。
然而,由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)催化生成的大量NO(nmol),主要介导细胞毒作用并引发细胞凋亡。
研究发现:
iNOS催化生成的NO可通过直接抑制核糖核酸还原酶及与DNA合成有关的酶活性,抑制DNA合成;或形成过氧硝酸盐(N2O3或N2O4),使嘌呤和嘧啶碱脱氨基,造成碱基错配、DNA突变、断裂;或引起3磷酸甘油醛脱氢酶糖基化及与线粒体呼吸链成员结合而抑制呼吸链的电子传递,使氧化磷酸化减弱,导致ATP生成减少〔11〕而引发细胞凋亡。
本研究经免疫组化对胰岛iNOS半定量结果分析显示:
衰老对照组胰岛内已呈现胞浆融合成片状的棕染iNOS,衰老糖尿病模型大鼠岛内细胞胞浆则呈现大量堆积融合成团、块状的棕褐色深染iNOS,即iNOS表达量显著增加,其与光镜(HE染色)和电镜所见到的衰老对照组胰腺组织细胞凋亡数增加,胰岛数量和面积减少,而衰老糖尿病模型组岛外腺泡细胞大量细胞凋亡以及胰岛数量、面积剧减,以及岛外腺泡细胞核膜皱缩,核染色质固缩、碎裂,呈现凋亡细胞典型特征的超微结构相一致。
另外,在胰岛形态学变化中,还发现衰老糖尿病模型组岛内细胞尤其是中心部细胞(为β、D细胞主要分布区,D细胞主要作用为平衡α、β细胞及分泌生长抑素)明显减少,甚至消失,因而一方面由于β、D细胞减少,α、β细胞平衡破坏,其与血生化表现的胰岛素明显下降,而胰高血糖素异常显著升高一致;另一方面胰岛内无论是电镜还是光镜均未见到明显凋亡细胞,其可能与胰岛β细胞大量死亡和或凋亡后被迅速清除,其清除速度显著高于岛外腺泡细胞有关,该结果与Shiva〔12〕报道相一致。
而且,一项大规模尸检发现,空腹血糖受损者和2型糖尿病患者β细胞数量均明显减少,并以后者更为显著〔6〕。
在2型糖尿病动物模型Zucker糖尿病肥胖鼠体内,亦有同样发现〔14〕。
老年人由于细胞功能减退,β细胞凋亡略高于增殖,加常伴有肥胖、高血脂、高血压等加速了β细胞凋亡,使β细胞数量逐渐减少,增加了老年人患糖尿病的危险性〔14〕。
推测D半乳糖注射可使NO增加,启动β细胞凋亡,而经D半乳糖加高脂高糖加低剂量STZ干预后的大鼠NO释放进一步增加,SOD活性下降,TNFα生成急骤增多,加之低剂量STZ注射造成β细胞损伤,其凋亡和或死亡大大增加,致使胰岛素/胰高血糖素分泌严重失衡,呈现糖、脂代谢严重紊乱,招致了衰老糖尿病的发生和发展。
提示NO和TNFα的综合作用在老年糖尿病的发病机制中有重要作用,其与衰老DM模型中存在的胰岛β、D细胞凋亡/死亡显著增加密切相关。
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