DNA提取与常见问题分析和对策.docx
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DNA提取与常见问题分析和对策
DNA提取和常见问题
分析及对策
主讲人:
关锰
DNA简单介绍
DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物
信息分子,是分子生物学研究的主要对象。
为了进行测序、杂交和基因的表达,获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
DNA提取原则
.保证DNA结构的完整性
.纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质
.排除有机溶剂和金属离子的污染
.蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度
.排除其他核酸分子的污染
DNA提取的几种方法
一、染色体DNA的提取
CTAB法
SDS法其它
DNA提取的几种方法
二、非染色体DNA的提取
质粒DNA的提取
•碱裂解法
•煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
•差速离心结合SDS裂解法
CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/LNaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注:
CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷
的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
CTAB法流程图
植物材料裂解液
异丙醇沉淀
液氮研磨抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
CTAB中各个组分的作用
CTAB提取缓冲液的经典配方
.Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
.EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子,抑制DNase活性;
.NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;
.CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
.β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使
酚容易去除。
CTAB提取缓冲液的改进配方
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚
形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。
除蛋白质:
✍氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机
相的分离;异戊醇则有助于消除抽提过程
中出现的气泡)。
✍使用变性剂变性(SDS.异硫氰酸胍等)
✍高盐洗涤
✍蛋白酶处理
除多糖:
>高盐法:
用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积
的5MNaCl,高盐可溶解多糖。
>用多糖水解酶将多糖降解。
>在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以
与多糖的羟基作用,从而去除多糖。
除酚类物质:
>在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:
β-巯基
乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫糖醇等
>加入易与酚类结合的试剂:
如PVP.PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合
除盐离子:
70%的乙醇洗涤
TE中成分的作用
>TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase
>pH值为8.0,可防止DNA发生酸解
称取样品,液氮研磨,加入预热的(65℃)CTAB及β-巯基乙醇
保温1h,期间不停的摇均
吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿:
异戊醇(24:
1),轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min
取上清液,移至新的离心管中,加等体积氯仿:
异戊醇,颠倒混匀,
10000rpm,10min
取上清液,加入0.6-0.7V的异丙醇(预冷),后4℃/-20℃保温沉淀
10000rpm,10min离心取沉淀,70%乙醇清洗两次,吹干
用TE溶解DNA,然后低温保存
应注意的问题
材料准备:
最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融。
液氮研磨:
研磨样品时要有液氮的保护,在整个过程中都不要让液氮挥发干净。
避免材料回温和反复冻融带来的降解。
此外尽量将样品研磨的很细,这样可以提高DNA产量。
细胞裂解:
材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低。
高温温浴时,定时轻柔振荡。
应注意的问题
DNA沉淀:
用乙醇或异丙醇都可以。
异丙醇沉淀的效率要高于无水乙
醇,试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀;而需要2倍体积的无水乙醇。
但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀,且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去。
DNA干燥:
晾干DNA,让乙醇充分挥发。
DNA溶解:
若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。
基因组DNA的检测
>高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象
>DNA浓度及纯度的检测A260=1约50μg/mL
>双链DNA,A260/280约为1.8
DNA提取常见问题
问题一:
DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。
原因
1.DNA中含有蛋白、多
糖、多酚类杂质
2.DNA在溶解前,有酒
精残留,酒精抑制对
后续酶解反应策
3.DNA中残留有金属离
子
4.有RNA的存留
•重新纯化DNA,过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质
•重新沉淀DNA,让酒精充分挥发
•增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)
•加入RNase降解RNA
DNA提取常见问题
问题二:
DNA降解。
原
因
1.材料不新鲜或反复冻融
2.未很好抑制源核酸
酶的活性对
策
3.提取过程操作过于剧
烈,DNA被机械打断
4.外源核酸酶污染
5.反复冻融
1.尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融
2.液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液
3.在提取源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔
4.所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌
5.将DNA分装保存于缓冲液中,避免
反复冻融
DNA提取常见问题
问题三:
DNA提取量少。
原
因
1.实验材料不佳或量少
2.破壁或裂解不充分对策
3.吸附或沉淀不完全
4.洗涤时DNA丢失
1.尽量选用新鲜(幼嫩)
的材料
2.植物要匀浆研磨充分
3.增加吸附的时间,或低温沉淀
4.小心操作