鸡卵类黏蛋白的分离纯化DOC.docx
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鸡卵类黏蛋白的分离纯化DOC
鸡卵类黏蛋白的分离纯化、活性及分子量测定
唐灵杰杨荣燕曹雪文唐威风
河北大学生命科学学院2013生物工程2班
摘要：
本实验的主要目的是掌握鸡卵类黏蛋白（CHOM）的性质及活性测定方法，了解其应用。
掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，掌握电泳仪的使用。
掌握离心机、分光光度计的使用。
鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶抑制剂，胰蛋白酶能水解酯键,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算类粘蛋白的活力。
先通过三氯乙酸-丙酮除去蛋清中的杂蛋白，后经等电点沉淀得到类粘蛋白的粗品；然后经过DEAE纤维素柱层析纯化得到纯品；用Folin-酚法测定粗品和纯品中蛋白质含量，紫外分光光度计测定其抑制活力；最后，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测类粘蛋白的纯度及分子量。
关键词：
鸡卵类粘蛋白纯化层析抑制活力分子量
Abstract:
ThemainpurposeofthisexperimentistograspthenatureandactivityofchickenovomucoidCHOM,andtounderstanditsapplication..Masterpolyacrylamidegelelectrophoresistechnology,mastertheuseofelectrophoresis.Mastercentrifuge,spectrophotometeruse.
Chickenovomucoidisakindofspecificitystrongtrypsininhibitors,canhydrolyzeesterkeys,amideskeysandpeptidebond.Usethisnatureandsyntheticsubstrateornaturalproteincandeterminethevitalityoftrypsin,socancalculatingthevitalityofchickenovomucoid.First,removethemiscellaneousproteinineggwhitebyTCA–acetone,thengettheroughproteinbyisoelectricprecipitation.Thenafterchromatographycolumnpackingcolumn,balance,Sample,elution,rebalanceetctoachievethepurificationofchickenovomucoid.thenwecangettheeligibilityproductfromDEAEcellulosecolumnchromatographyatlast.ThecontentsofproteinincrudeandpureproductsweredeterminedbyFolin-phenolmethod,andtheinhibitionactivitywasdeterminedbyultravioletspectrophotometry.Finally,throughSDS-pagepolyacrylamidegelelectrophoresistodeterminethepurityandmolecularweightofchickenovomucoid.
Keywords：
ChickenovomucoidPurificationChromatograminhibitoryactivitymolecularweight
1前言
鸡卵类黏蛋白（ChickenOvomucoid,CHOM）是从鸡卵清中分离的糖蛋白，具有强烈抑制胰蛋白酶的的作用，是典型的胰蛋白酶抑制剂，常用于胰蛋白酶及类胰蛋白酶的酶学性质研究。
CHOM在pH7.8-8.0的碱性条件下，具有很强的结合胰蛋白酶的活性，而且这种结合是可逆的，因此，可以制成亲和吸附剂，用以纯化胰蛋白酶。
鸡卵类黏蛋白为糖蛋白，在糖蛋白的糖链部分（主要是D－甘露糖、D－半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上有差别，所以，在电泳行为上常呈现不均一性，经常表现为弥散性条带。
目前至少已获得四种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶性能上及氨基酸组成上没有多大的区别。
鸡卵类黏蛋白的等电点有一定的范围：
大致在pH3.9－4.5，分子量在28000Da。
其抑制胰蛋白酶的摩尔比为1：
1，1μg高纯度的卵类黏蛋白能抑制相当于0.86μg的胰蛋白酶（比活力为12000BAEEU/mg）。
不同来源的卵类黏蛋白的N-末端残基有很大差异，鸡卵类黏蛋白的N-末端为Ala，C-末端为Phe。
卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的尿素很稳定，在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。
鸡卵类黏蛋白对猪、牛的胰蛋白酶强烈抑制，对枯草杆菌蛋白酶有一定程度的抑制，但对人的胰蛋白酶无明显的抑制作用，对胰凝乳蛋白酶也无抑制作用。
2材料与方法
2.1材料
新鲜鸡蛋、0.05mol/L三氯乙酸溶液（TCA）、丙酮溶液、DEAE-纤维素、0.2mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液、0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液、0.3mol氯化钠-0.02molPH6.5磷酸盐缓冲液、0.5mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液、3.0mLBAEE-0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液、0.5mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液、0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液胰蛋白酶、Folin-酚试剂：
试剂甲：
①4%碳酸钠溶液；②0.2mol/L氢氧化钠溶液③1%硫酸铜溶液；④2%酒石酸钾钠溶液。
先将①②等体积混合，再将③④等体积混合，再将这两种混合液按50：
1的比例混合，试剂乙、30%胶母液、pH8.9Tris-HCl缓冲液（含TEMED）、10%APs、pH6.7Tris-HCl缓冲液（含TEMED）、pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液、BSA、Marker、考马斯亮蓝染色液、脱色液。
2.2仪器
离心机、恒温水浴锅、冰箱、紫外分光光度计、电泳仪、摇床、核酸蛋白检测仪、漏斗、透析袋、离心管（1.5mL）、烧杯（250mL、500mL、1000mL）、吸量管（0.5mL、1mL、5mL）、层析柱、铁架台、石英比色皿、微量进样器、十齿样品梳（厚度1mm）、细长头滴管离心管（1.5mL）、培养皿、成套玻璃板。
2.3方法
2.3.1有机溶剂分级沉淀CHOM粗品
2.3.1.1去除杂蛋白
两人一组，量取25mL新鲜鸡蛋清，盛于250mL烧杯内，烧杯置于25～30℃恒温水浴锅内，边搅拌边缓慢加入等体积4℃预冷的三氯乙酸（TCA）－丙酮溶液（1:
4体积比），出现大量白色沉淀，为杂蛋白，此时溶液的pH约为6～7，保温30min。
用大约7～8mL0.5mol/LTCA调节至pH3.5，使杂蛋白沉淀完全，在4℃下放置1h,4000r/min离心20min，轻轻将黄绿色上清液倒出，每2个人量取20mL（剩余的上清液扔掉），4个人合并为1组，共40mL，倒入250mL三角瓶中，用纸封口、贴标签放入冰箱中冷藏。
2.3.1.2沉淀粗品
4倍于上清液体积的-20℃预冷的丙酮（160mL），边搅拌边加入黄绿色上清液中，可见白色沉淀产生，在4℃冰箱中放置1－2h。
（课程安排在上午的，前一天下午沉淀，第二天上午上课时再离心）。
从冰箱中轻轻（不要将沉淀晃起！
）取出三角瓶，将上清液缓慢倒出，尽量少留上清液，总体积最多不超过40mL。
两两配平，4000r/min离心20min，弃上清液，得CHOM沉淀，加入4mL无离子水溶解。
2.3.1.3粗品获得
透析操作需戴上一次性手套或胶皮指套，以防手上的汗液等污染透析袋。
将透析袋用无离子水煮沸10min，再用无离子水清洗干净，一端用橡皮筋绑紧，用无离子水试漏，若不漏，再将4mL粗酶液装入透析袋，赶出透析袋中的气泡，留出约0.5cm富余，绑紧另一端，对无离子水透析，更换数次无离子水，以除去残留的TCA和丙酮，透析后可见少量沉淀（为变性蛋白），需离心去除。
透析过程至少需要2.0h，隔1h更换一次无离子水。
用滴管取出透析袋中的黏蛋白溶液（及时将透析袋用无离子水清洗干净），放入7mL离心管8000r/min离心10min，弃沉淀，上清液倒入另一7mL离心管，贴好标签，放入冰箱冷冻。
2.3.2DEAE-Cellulose纯化CHOM
2.3.2.2DEAE-纤维素的处理及再生
新纤维素的处理：
取50gDEAE-纤维素-32或DEAE-52，用少量水溶胀1h，用0.5mol/L氯化钠-0.5mol/L氢氧化钠溶液搅拌处理20min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/L盐酸与0.5mol/L氯化钠溶液搅拌处理20min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/L氯化钠溶液—-0.5mol/L氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。
旧纤维素的再生：
省去酸处理一步，只用0.5mol/L氯化钠溶液-0.5mol/L氢氧化钠溶液处理一次，用大量的蒸馏水洗至中性，置4℃冰箱中保存。
2.3.2.3装柱
取一支层析柱，检查上下端的螺口，用洗耳球吹硅胶管，使之通气。
下端螺口旋紧，用水止夹紧软硅胶管。
将层析柱垂直安装在铁架台上，先加入1/3～1/2柱体积的水，在柱的上端插一合适大小的玻璃漏斗，使漏斗颈的外径与层析柱的内径吻合，以防层析柱中的水或缓冲液渗出。
将处理好的DEAE-纤维素调成浆糊状，倒入漏斗，不断搅拌，使之自然沉降到1cm左右的高度。
打开柱下端的水止，继续搅拌漏斗内的纤维素，使之沉降至3/4柱高。
计算柱体积：
量测柱床的高度，柱内径为1cm，底面积乘以高位柱床体积。
将柱下端的硅胶管连接在核酸蛋白检测仪样品池的入口，打开核酸蛋白检测仪电源，将波长置于280nm处，预热至少30min，准备一个烧杯，收集样品池出口的流出液。
2.3.2.4平衡
用3倍柱体积的0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液（起始液）平衡层析柱。
始终保持柱床上边最少有2cm高度的缓冲液。
平衡过程中要做3件事情：
1、调节流速，使之在1～1.5mL/min之间；2、调试核酸蛋白检测仪：
调透光率为100，吸光度为0。
首先将旋钮拨到T100%（指透光率），调“光量”到显示100。
再将旋钮拨到A（吸光度）（A有不同灵敏度，一般选择0.5A），调节“调零”到显示0（图6）。
继续平衡，如数字有波动，反复调节几次，使A值保持为0；3、粗品的处理：
首先用10mL量筒测量上周离心后的粗品体积，记录体积！
记为Vcrude。
取1支7mL离心管，加入0.20mL0.2mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液，摇匀，1.8mL粗品，混合，盐终浓度为0.02mol/L，用于本次纯化实验。
剩余粗品都装入原来的7mL离心管，用于蛋白质浓度测定、活性测定和电泳。
2.3.2.5上样
待平衡缓冲液即将全部流入柱床时，立即贴壁加2.0mL粗提样品，使样品全部缓慢流入层析柱床内，立即加起始液到柱床上边保持2cm高度（图7）。
记录上样时间，几点几分。
2.3.2.6洗脱
①起始液洗脱
首先以3倍柱体积的起始液洗脱，保持流速不变，观察核酸蛋白检测仪的A值变化情况。
当A值上升时，开始计时，并记录A值，当A值上升到最高值时，计时，并记录A值，A值下降到数值稳定时，计时，并记录A值。
若有蛋白流出，一般为溶菌酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂等杂蛋白。
②0.3mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液洗脱
改用0.3mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱。
当A值急剧上升时收集，并计时，观察A的变化并记录A值和时间点。
当A值上升到最高值时，计时，并记录A值，下降到数值稳定时，计时，并记录A值。
（将洗脱峰的情况记录下来）
每管收集2mL。
准备更换另一种洗脱液。
若收集的洗脱液体积较小（小于5mL），则不需要浓缩！
若洗脱体积过大，纯品浓度较低，不能直接用于活性和蛋白质浓度测定，需要进行反透析。
先合并对应A值较高的收集液试管，如果透析袋装满，A值较低的收集液弃去不用。
如果透析袋未装满，则合并A值较低的收集液。
每组装满一根透析袋，上面加蔗糖晶体，利用蔗糖吸水性质，将透析袋里边的水吸出，最后，透析袋内的溶液浓缩到2~3mL之间。
将干瘪的透析袋一端的橡皮筋解开，将浓缩的纯品溶液（较粘）集中在一端，重新绑好皮筋（注意不要留空隙！
）。
透析袋再对无离子水透析（透析好的纯品，图10），测定纯化后鸡卵类黏蛋白的总体积，记为Vpurified，最大体积不要超过5mL。
③0.5mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液洗脱
继续用0.5mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液洗脱，观察是否有蛋白峰出现，如有蛋白峰，继续收集。
一般情况下不再有蛋白峰出现。
洗脱1个柱体积的溶液即可。
④起始液平衡
用1倍柱体积起始液继续平衡柱子。
用吸耳球将柱子内的纤维素吹到回收瓶回收。
⑤清洗核酸蛋白检测仪的样品池
以10mL无离子水清洗核酸蛋白检测仪样品池，从进样口注射无离子水，至出样口流出。
2.3.3粗品及纯品蛋白质浓度测定
2.3.3.1样品准备
实验三得到的CHOM纯品测量体积，记为Vpurified，装入7mL离心管中。
取1mL纯品稀释：
柱层析洗脱峰最大值在100以内的，先稀释5倍1。
柱层析洗脱峰最大值大于100以的，直接稀释10倍。
再取1mL用于本实验蛋白质浓度测定。
若A值超出标曲范围，在原来基础上再进行稀释。
从剩余粗品（稀释50、100倍），用于本实验蛋白质浓度测定。
2.3.3.2标准曲线的制作及样品的测定
试剂
管号及加量
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
BSA溶液/mL
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
0
0
0
无离子水/mL
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
0
0
0
蛋白质浓度/（ug/mL）
0
50
100
150
200
250
-
-
-
-
待测试样品/mL
0
0
0
0
0
0
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀，于20-25℃放置10min
Folin-酚试剂甲/mL
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
Folin-酚试剂乙/mL
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
迅速混匀，于30℃水浴保温30min，以1号管反应液为空白，测A640
A640
0
注：
7号：
粗品稀释100倍8号：
粗品稀释100倍
9号：
纯品稀释20倍10号：
纯品稀释20倍
保温30min后，在722分光光度计上640nm处比色，以1号管溶液凋零，记录各试管的A640。
计算CHOM粗品、纯品的蛋白质浓度（单位：
mg/mL）；查阅记录的Vcrude和Vpurified，计算粗品和纯品的总蛋白质含量（mg）。
2.3.4BAEE法测定CHOM活性
2.3.4.1胰蛋白酶活性测定
本实验采用10mg/mL胰蛋白酶溶液，加量为50μL。
取一只石英比色皿（带盖，光程为1cm），加入25℃预热的BAEE3.0mL，在紫外分光光度计的动力学模式下，测定A253，以此为空白，校正100%T/0Abs。
取出比色皿，加入50μL胰蛋白酶液（酶浓度10mg/mL），立即混匀，测定A253的增加，每隔30秒读一次数，测定185秒。
一般情况下，此浓度酶液催化底物显色，A值呈线性增加.
计算胰蛋白酶活性和比活力：
根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔（∆t）与相应吸光度值变化（∆A），按以下公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。
胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）=∆A/∆t×0.001；
比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=（∆A/∆t×0.001）÷M测；
（式中:
∆A/∆t为每min吸光度值的增加）
M测指测定时所加胰蛋白酶的量，单位为mg；
（M测=50μL×10mg/mL=500μg=0.5mg）
0.001为吸光度值增加0.001单位定为1个BAEE活力单位的常数。
2.3.4.2黏蛋白粗品的抑制活力
（1）调节粗品pH至8.0，浓度至0.05mol/L：
从剩余粗品管中，取0.9mL，加入0.10mL的0.5mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，混匀，使缓冲液为0.05mol/LpH8.0Tris-HCl，供本次实验BAEE法测定黏蛋白对胰蛋白酶的抑制活性之用。
剩下的依旧放冰箱冷冻保存。
粗品的稀释：
从调节好pH的1mL粗品溶液中，取10μL粗品，加90μL0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，混匀（即稀释10倍）。
（3）粗品对胰蛋白酶的抑制作用
取20μL稀释的粗品与100μL胰蛋白酶溶液混合、混匀（卵类蛋白量不能超过胰蛋白酶量，一般以抑制50%较为合适，具体视卵类黏蛋白的纯度而异），在25℃保温10min，使酶与抑制剂充分结合。
（4）粗品抑制后剩余活力测定
取一只石英比色皿，加入25℃预热的3mLBAEE，动力学模式下测定A253，以此空白校准。
将黏蛋白粗品抑制后的60uL混合液，加入比色皿中，迅速混匀（盖盖，颠倒混匀！
），动力学模式下测定A253变化，每隔30秒读一次数，测定185秒。
记录每30秒的测定数据。
测定一个样品之后，一定要按“Esc”退出。
倒掉石英比色皿中的液体，清洗干净！
测定下一个样品，重新装入3mLBAEE，一定要重新按“100%T/0Abs”校准。
根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔（∆t）与相应吸光度值变化（∆OD），按前述公式计算粗品抑制后的胰蛋白酶剩余活力。
胰蛋白酶活力（U）－粗品抑制后的剩余活力（U）=黏蛋白粗品的抑制活力（U）。
计算出每mL粗品的抑制活力，再乘以粗品体积，计算出黏蛋白粗品的总抑制活力。
2.3.4.3黏蛋白纯品的抑制活力
（1）调节纯品的pH至8.0，浓度至0.05mol/L
从剩余的纯品管中，取0.9mL纯品，加入0.10mL0.5mol/LpH8.0Tris-HCI缓冲液，使缓冲液为0.05mol/LpH8.0Tris-HCl，供本次实验BAEE法测定纯品对胰蛋白酶的抑制活性.剩下的依旧放冰箱冷冻保存。
（2）纯品对胰蛋白酶的抑制作用
取20μL纯品与100μL胰蛋白酶溶液混合（卵类蛋白量不能超过胰蛋白酶量，一般以抑制50%较适合，具体视卵类黏蛋白的纯度而异），在25℃保温10min左右，使酶与抑制剂充分结合。
（3）纯品抑制后的剩余活力测定：
在一只石英比色皿中，加入25℃预热的3mLBAEE，动力学模式下测定A253，以此调零。
将黏蛋白纯品抑制后的60uL混合液，加入比色皿中，混匀（盖盖，颠倒混匀！
），动力学模式下测定A253变化，每隔30秒测定一次，记录数据，测定3～5min。
根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔（∆t）与相应光密度值变化（∆OD），
按前述公式计算抑制后的胰蛋白酶剩余活力。
胰蛋白酶活力（U）－纯品抑制后的剩余活力（U）=黏蛋白纯品的抑制活力（U）。
计算出每mL粗品的抑制活力，再乘以粗品体积，计算出黏蛋白粗品的总抑制活力。
2.3.5SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测CHOM纯度及相对分子质量
2.3.5.1配制分离胶和灌胶
1、分离胶制备及灌胶：
按下表配制分离胶
表2SDS-PAGE分离胶的配制方法
试剂
加量
30%胶母液/mL
2.8
pH8.9Tris-HCl缓冲液/Ml（含TEMED）
1.8
蒸馏水定容至/mL
7
混匀后加入10%APS/uL
50
灌分离胶：
先将配制的分离胶加在玻璃板之间，7mL胶液几乎全部灌入，至高出灰色横梁2mm。
在加入过硫酸铵之后，应在5min内灌胶。
再取100微升水，轻轻加在胶面上。
2、浓缩胶制备及灌胶：
按下表配制浓缩胶
表3SDS-PAGE浓缩胶的配制方法
试剂
加量
30%胶母液/mL
0.4
pH6.7Tris-HCl缓冲液/Ml（含TEMED）
0.2
蒸馏水定容至/mL
3
混匀后加入10%APS/uL
40
灌浓缩胶：
一定要待分离胶聚合以后（大约20-30min），可见水与凝固的胶面之间有折射率不同的界线，倒去上层水，再用滤纸条吸去胶面上多余的水，注意不要碰到胶面。
灌浓缩胶，插上样品梳（注意：
梳子的平面对准高玻璃板）浓缩胶大约20min聚合。
2.3.5.2加入电极缓冲液
在电泳槽中加入pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液（旧），使之没过电极丝即可；在矮板之间加入pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液（新），使之没过矮板。
2.3.5.3点样样品的制备
低分子量Marker由指导教师准备，每组用一支Marker。
牛血清白蛋白（BSA）：
取0.5mL离心管，加25μLBSA（0.5mg/mL）和25μL样品缓冲液，混匀，由指导教师准备；
粗品CHOM：
取1.5mL离心管，加100μL粗品和100μL2×样品缓冲液，混匀；
纯品CHOM:
取1.5mL离心管，加100μL纯品和100μL2×样品液，混匀；
4支离心管置海绵托上沸水浴加热3min；
制样之后，将纯品和粗品管放回塑料袋，冷冻保存。
2.3.5.4点样
按下表点样：
表4SDS-PAGE上样表
泳道
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
样品
粗品
粗品
粗品
粗品
BSA
Marker
纯品
纯品
纯品
纯品
点样量（ul）
10
15
20
30
10
20
10
15
20
30
2.3.5.4电泳
A：
在电泳槽的正极槽加电泳缓冲液，没过电极丝即可；负极槽加缓冲液，一定要没过矮玻璃板。
B：
插好电泳仪电源，连接电泳仪和电泳槽之间的电极线。
样品在浓缩胶里，调节电压：
150V。
样品在分离胶里，调节电压：
200V。
当指示剂染料距离凝胶底部约1cm时，停止电泳，记录电泳时间。
2.3.5.5剥胶
A:
弃去电泳槽正极缓冲液，回收负极缓冲液。
B:
取出玻璃板，小心撬开玻璃，在1#上样井对应的胶底部切下一个小三角做标记。
小心将胶剥入大培养皿中（大培养皿底的边上贴好各组的标签）。
2.3.5.6染色、脱色
A:
在大培养品皿中加入考马斯亮
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