Biorad MicroPulser电穿孔仪中文说明书.docx
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BioradMicroPulser电穿孔仪中文说明书
MicroPulser电穿孔仪操作手册
2018年12月27日
1、介绍
（1）基本原理
MicroPulser电穿孔仪用于细菌、酵母和其他众多微生物的电击转化，转化时，高压电脉冲作用于悬浮在小体积高阻介质中的样品。
本系统由一个脉冲发生器（pulsegenerator）模块、一个电击腔（shockingchamber）和一个装有电极的电击杯（cuvette）组成。
样本放置于电击杯的电极之间。
MicroPulser模块包含一个电容器，将电容器充电至高电压，然后模块将电容器中的电流放电到试管中的样品中。
MicroPulser的电容放电电路产生具有指数衰减波形的电脉冲，如下图。
当电容器放电至样品时，跨越电极的电压迅速上升至最大电压（or峰值电压，peakvoltage；也称为初始电压，Vo），并随时间（t）减小，如下式：
其中τ=R·C，为时间常数，是脉冲长度的简便表达式。
R为电路电阻，单位为ohms（欧姆）。
C为电容，单位为microfarad（微法拉）。
根据方程1，τ是电压下降至峰值电压1/e（~37%）的时间。
MicroPulser的内部电路被设计以使E.coli、酿酒酵母及其他许多微生物可以得到最佳电穿孔，最佳转化效率发生在大约5ms的时间常数内。
这些电穿孔条件是通过使用10微法拉电容器和将600欧姆电阻与样品池并联以及将30欧姆电阻与样品池串联来实现的。
除时间常数外，电场强度是另一个决定转化效率的重要参数。
电场强度E，是施加于电极间的电压，公式为：
其中，V为施加的电压，d为电极间的距离，单位为cm。
电场强度和细胞的尺寸（size）决定了横贯每个细胞的电压降，正是电压降可能是电穿孔中电压效应的重要表现。
30欧姆串联电阻的目的是在发生电弧的情况下保护设备电路。
在正常操作条件下，当样本在高电阻介质中，电阻不会影响施加在样本上的电压。
但是，当样本的电阻较低时，电阻将极大地降低施加在样品上的电压。
施加在样品上的电压的分压降（fractionaldrop）由下式得到：
当Rsample为600欧姆，对于样品就会有5%的电压降（30/（30+600）=0.048）。
基于这个原因，当样品溶液的电阻低于600欧姆时，不应进行电穿孔试验。
这包括培养基未彻底从细胞中去除的样本，残留有NaCl的DNA样本或连接混合物。
MicroPulser能够测量样本的电阻，若样本介质电阻过低则不会进行操作。
（2）仪器参数操作（Manipulationofinstrumentparameters）
MicroPulser仪器的一些参数可以进行设置以达到最大转化效率，包括场强E，时间常数τ，截断指数衰减脉冲的宽度。
场强的设置可以有两种方式进行操作。
一是，介于200-3000V电压可以直接在仪器上设置，这是最容易控制的。
改变电压而保持其他条件不变是大多数电穿孔优化程序的基础。
第二，使用不同电极间隙宽度的电转杯也是改变场强的一种方法。
对于微生物的电穿孔，0.1和0.2cm间隙的电转杯最常被使用。
E.coli的电穿孔当使用0.1cm电转杯时通常使用1.8kV电压（E=18kV/cm），而使用0.2cm电转杯时使用2.5kV电压（E=12.5kV/cm）。
这些电穿孔条件作为预设程序内置于MicroPulser中，分别位于细菌设置菜单中的Ec1（V=1.8kV）和Ec2（V=2.5kV）。
另外，细菌设备菜单中的第三个程序Ec3的电压为3.0kV（当电转杯为0.2cm时E=15kV/cm），我们发现可以得到比2.5kV更高的转化效率。
时间常数可以通过改变样品的电阻而改变。
样品电阻的改变可以通过两种方式。
一是，增加电穿孔介质的盐浓度或缓冲浓度会降低样品的电导，反之亦然，结果导致时间常数的改变。
第二，电转杯中样品体积与样品电阻呈反比，降低样品体积会增加样品电导。
样品体积对电导的影响在低电阻介质中是最显著的。
这些影响因素将会在后面部分进一步介绍。
MicroPulser还包括一种在电压大于600V时比预期时间常数更快截断指数衰减脉冲的方法。
当脉冲被MicroPulser终止时，电压只在样品上作用指定长度的时间，可能在1.0~4.0ms之间。
下图显示了这种波形和真正的指数衰减脉冲的差异。
2、影响电穿孔的因素
通过多年的研究，证实了微生物电穿孔的电条件（seeChang,etal.,1992,andNickoloff,1995,foroverviewsaswellasforprotocolsonelectroporationofnumerousspecies）。
对大多数微生物而言，最佳电转化发生在与E.coli和酿酒酵母所使用的电转化条件相似的条件下，E.coli和酿酒酵母是当今研究中最常使用的两个物种。
对于E.coli的电穿孔，文献报道最常使用的条件是0.2cm电转杯，40μl细胞样本，电压2.5kV，时间~5ms。
对酿酒酵母，报告中最常使用的条件是0.2cm电转杯，40μl细胞样品，1.5kV电压和时间常数~5ms。
对许多细菌而言，如沙门氏菌属（Salmonella）、假单胞菌属（Pseudomonas）、幽门螺杆菌（Helicobacter）、包柔式螺旋体属（Borrelia）、链球菌属（Streptococcus）、乳球菌属（Lactococcus）和肠球菌属（Enterococcus），电穿孔条件与E.coli一样。
而对于其他的细菌，改变电场强度可以得到更高的电转化效率。
一个相似的案例可见于其他种属的酵母。
MicroPulser的设计可以精确施加E.coli和酿酒酵母获得最佳转化效率所需的脉冲参数。
当使用高阻样本时，时间常数被设置为5ms。
对于这些微生物，MicroPulser预先设定了在0.1或0.2cm的电击杯中电穿孔大肠杆菌，或在0.2或0.4cm的电击杯中电穿孔酿酒酵母时输送正确电压的程序。
（1）细胞生长（CellGrowth）
对于大多数细菌而言，在对数生长期的早期或中期收获细胞，可以得到最高的转化效率。
对于E.coli，当细胞进行稳定期，转化效率剧烈下降（Dower，1990）。
相反，大多数酵母通常在对数生长的中期至晚期收获细胞。
对于酿酒酵母（S.cerevisiae），对数生长晚期的培养物相比早期的培养物，转化效率提高了60倍（BeckerandGuarente，1991）。
获取细胞的最佳生长期通常随细胞种类而异。
当制备一种新的物种的感受态细胞时，最好使用为同种属而制定的程序。
对所需考虑因素的建议和常用的制备感受态细胞的方法在Doweretal（1992）和Trevorsetal（1992）的文章中被详细讨论。
（2）DNA
大多数的电穿孔应用是将质粒DNA转入细胞中，需要提及的是，几乎任何形式的分子都可以通过电穿孔被导入细胞中，包括DNA、蛋白、糖类、小分子等。
除了少数例外，当导入自主复制质粒时，使用超螺旋质粒进行电穿孔可以提高转化效率。
但是，将整合入宿主基因组的质粒当使用线性化质粒时，转化效率较高。
例如，假丝酵母、毕赤酵母和四膜虫使用线性质粒比超螺旋质粒效率更高。
在E.coli和单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）电穿孔转化时，使用松弛型环状质粒（relaxedcircularplasmid）仅比使用超螺旋质粒的转化效率略低（LeonardoandSedivy，1990，ParkandStewart，1990）。
但是，在E.coli和Streptococcuspyogenes（酿脓链球菌）的电穿孔转化时，线性质粒比环状质粒的转化效率低103-104倍（ShigekawaandDower,1988,SimonandFerretti,1991）。
在大多数物种中，每mol数量的质粒的电穿孔效率随着质粒大小的增加而降低，包括E.coli（LeonardoandSedivy,1990,Siguretetal.,1994），Pseudomonasaeruginosa（假单胞菌属）（DennisandSokol,1995），和Streptococcusthermophilus（嗜热链球菌属）（SomkutiandSteinberg，1988）。
但是，有些物种，包括Lactococcuslactis（乳球菌属）（HoloandNes，1995），Enterococcusfaecalis（肠球菌属）（Cruz-RodzandGilmore，1990）和Clostridiumperfringens（产气荚膜梭菌）（AllenandBlaschek，1990），转化效率似乎与质粒大小（即使高达20-30Kb）无关。
尽管微生物的转化使用各种方法提取的质粒都可以完成，但质粒的纯度是影响转化效率的一个因素。
未纯化的小量制备的质粒DNA的转化效率明显低于经过各种方法纯化的质粒DNA。
利用Bio-RadQuantummatrix制备的质粒与CsCl纯化质粒转化效率相当。
通常，对于所有种类的微生物，转化频率随着DNA浓度的增加而增加。
对于E.coli，转化频率（转化子/活细胞）受DNA浓度影响的范围在106（10pg/mlto7.5µg/ml），在这个范围内，DNA浓度决定了细胞被转化的概率。
在较高的DNA浓度，高达80%的活细胞可被转化（Doweretal，1988）。
因为获得的转化子的数量是转化频率和细胞数量的产物，转化效率（转化子/ugDNA）在109-3×1010细胞/ml范围内随细胞浓度增加而增加。
因此，为了获得高的转化频率（transformationfrequency），请使用高的DNA浓度。
为了获得高的转化效率（transformationefficiency），请使用高的细胞浓度（和低的DNA浓度以防止共转化cotransformation）。
在每个实例中，小的样本体积（20-50μl）允许经济地使用DNA和细胞（seeDoweretal.,1988,foradetaileddiscussionofthesefactors）。
（3）电穿孔介质（ElectroporationMedia）
MicroPulser被设计以使用具有高阻介质的样本。
基于此，当制备感受态细胞时，洗涤以彻底去除培养基是非常重要的。
若未彻底去除细胞中的培养基将导致电穿孔时在样本中产生电弧。
细胞应该用水或低离子强度的溶液如蔗糖、甘油、葡萄糖、山梨醇或PEG洗涤至少3次。
对许多微生物而言，甘油是一种方便的电穿孔介质，因甘油通常被用于细胞保存的冷冻保存液。
下图展示了几种不同生物学上的重要离子溶液对样品电阻的浓度效应。
注意几点：
体积对样品的电阻有重要影响——对离子溶液，样品电阻和电转杯中样品的体积呈反比；
含有二价离子的溶液的电阻比含有相同浓度单价离子的溶液电阻低；
缓冲溶液的电阻受pH值影响。
即使极低浓度的离子化合物的加入都可以显著降低样品的电导，进而引发电弧作用。
通过乙醇沉淀法制备的DNA中残留的盐应该在用水或TEbuffer溶解DNA前洗涤DNA以降低盐浓度。
表1表明，虽然将含有10mMTris，1mMEDTA，pH8.0溶液的质粒加入水中，确实会降低样品的电导，但这应该不会导致不能使用MicroPulser进行电穿孔试验。
可以直接使用酶反应的DNA进行转化，但进行高压脉冲操作时，最终电穿孔样品中的盐浓度应该保持在低于~5meq的水平。
最后，连接混合物可能可以用于转化，但DNA加入量必须极低或者通过稀释（WillsonandGough，1988）、透析（HeeryandDunican，1989；Jacobsetal.,1990）或乙醇沉淀（Böttger,1988；ZabarovskyandWinberg，1990）降低离子强度。
3、MicroPulser操作说明
参见图1了解MicroPulser的各个组件，图5标注了各个按钮和LED的名称。
3.1设置MicroPulser系统
✓将黑色电源线连接到MicroPulser脉冲发生器模块的后面板。
将电源线插入墙上的插座或电源线。
✓拉下MicroPulser底部的折叠脚。
将该脚插入电击腔底部的轨道中。
将电击腔滑块滑入电击腔。
✓将从电击腔引出的导线连接到MicroPulser前面板上的输出接口上；极性对电穿孔过程并不重要。
✓打开电源开关。
LED灯应亮起并且显示为“Ec1”，随后LED指示细菌设置状态（BacteriaSetteing）。
3.2MicroPulser的操作
（1）选择预设的程序
MicroPulser预设了数种常见的微生物的电击程序如下:
循环按“Settings”键选择“Bacteria”、“Fungi”和“Manual”。
当“Fungi”旁的LED灯亮时，预存储的真菌转化程序即被调出。
按“上”和“下”键可在不同的真菌转化程序间切换。
电击的参数自动按显示的程序设定。
同样的，选择“Bacteria”程序相同。
不管是选择“Bacteria”，还是“Fungi”程序，同时按住“上”“下”键可以在LED屏上显示选定程序的参数。
显示屏上首先显示的是电压值，然后是“t”。
如果一个程序的时间和多次脉冲相关，则显示“P”，然后显示“2”，表示将会进行两次连续的脉冲。
如果没有给定“t”，则脉冲是非截短的（nottruncated），而如果没有“P”被给定，则是单次脉冲。
（2）使用MicroPulser的手动模式
A.改变电压
按“Settings”键，当“Manual”旁的LED灯亮时，显示屏显示电压值（单位kV）。
按“上”和"下"键在0.20kV-3.00kV之间改变电压。
如果仪器刚刚打开，显示值为“0.00”。
B.截短脉冲.
当“Manual”旁的LED灯亮时，同时按“上”和"下"键LED屏显示“t---”，表示为脉冲选择了时间。
开机时的默认设置为标准的指数衰减脉冲，或衰减过程不被截短，显示为“--”。
同时按“上”和"下"键后只松开“下”键，显示数字为截短的脉冲持续时间，单位为毫秒，从1毫秒“t1.0”开始以0.1毫秒为增量一直到4毫秒“t4.0”。
这将限定脉冲时间在1-4毫秒之间。
同时按“上”和"下"键后只松开“上”键，可以调整指定的脉冲截短时间到更短。
（3）脉冲功能
按“Pulse”键到电容充电至设定电压；显示屏上显示“PLS”。
当脉冲完成后会发出一次响声，如果是一次设置好的多重脉冲则在整个脉冲过程中每次脉冲后均会发出一次响声，“PLS”则一直在显示屏上显示。
要想手动进行多重脉冲，则可以在一次脉冲完成且响声停止后，再次按“Pulse”键。
如果发出比较低程度的响声，伴随着“Arc”在显示器上显示，则表明系统预防和淬灭（ARQ）系统被启动，脉冲被中止。
这通常是电击杯被击穿的迹象，如果样品电阻太小，电击杯仍可能被击穿。
因为在“ARQ”事件中释放的能量很低，重新设置一个不会产生电弧的参数对样品重新电击也可能会得到可接受的结果。
但是，不建议使用经历了两次电弧事件的样品。
（4）测量
按“Measurements”键可以点亮"ActualkV"LED.显示最后一次脉冲试验的实际电压（单位kV），如果仪器刚刚开机并且没有使用过，显示器显示"0.00"。
再次按“Measurements”键可以点亮“Timems”LED，显示上次脉冲持续时间。
按住“测量”按钮，LED显示屏将在实际电压和时间常数之间切换。
3.3使用MicroPulser进行电穿孔
✓将细胞悬液移入电转杯中，轻敲液体使之落入电转杯底部。
0.2cm电转杯最多可装0.4ml溶液，0.1cm电转杯最多可装80μl溶液。
注意，温度会对转化频率产生重要影响。
某些微生物的电转，包括E.coli和酿酒酵母，在冷的电转杯中转化效率更高。
✓将电转杯插入电击腔的滑槽中。
将滑槽推入电击腔使电转杯与电击腔的电极紧密接触。
✓按黄色“Pulse”按钮，给电容器充电并发出脉冲；LED显示屏将显示“PLS”，直到一个声响结束表明脉冲已经给出。
LED显示屏将显示程序，时间常数，或实际输出的电压，这取决于选择的LED。
✓从电击腔取出滑槽，并取出电击杯，处理电击好的样品细胞。
✓按下“测量”按钮，在显示屏LED上显示发送到样品的时间常数和实际电压。
当“ActualkV”旁的LED亮起时，电压显示为“kV”。
再次按下“measurement”按钮即可显示时间常数。
“Timems”旁边的LED灯亮；时间常数以“ms”为单位。
✓按下电源按钮关闭仪器。
如果需要，样品电击腔现在可以安全地断开。
在导线断开之前，不要拆卸电击腔盖。
4、E.coli的高效电转化
E.coli电转化的转化效率可达109-1010转化子/μg，这比最好的化学转化法的转化效率都要高。
下面的protocol描述了一种用于高效电转化的E.coli感受态细胞的制备方法。
我们也对通过电穿孔转化的其他菌株感兴趣，并将此信息收录在我们的电转化手册的后续版本中。
4.1制备电转化感受态细胞
参考Ausubeletal.（1987）、Miller和Nickoloff（1995）的文章获得更详细信息。
✓向500mlLB培养基中按1%接种量接种新鲜的过夜E.coli菌液。
✓37℃、300rpm培养至OD600约为0.5-0.7（对数生长早期至中期收获的细胞可获得最佳的转化结果，因此，适当的细胞密度取决于菌株和生长条件）。
✓将菌液在冰上放置20min。
随后的步骤中，尽可能保持细胞接近0℃（置于冰/水浴中），在加入细胞之前，在冰上预冷所有的容器。
转移细胞至预冷的离心管中，4℃、4000g离心15min。
✓小心倒去上清液。
为了彻底去除培养基，宁可倒去部分细胞、牺牲收率。
✓用500ml冰预冷的10%甘油溶液轻柔重悬细胞沉淀。
4℃、4000g离心15min，小心倒去上清液。
✓用250ml冰预冷的10%甘油溶液轻柔重悬细胞沉淀。
4℃、4000g离心15min，小心倒去上清液。
✓用20ml冰预冷的10%甘油溶液轻柔重悬细胞沉淀。
转移至一个30ml无菌Oakridge管中。
4℃、4000g离心15min。
小心倒去上清液。
✓用1-2ml冰预冷的10%甘油溶液轻柔重悬细胞沉淀。
细胞浓度应在1-3×1010cells/ml范围内。
本悬液可以冷冻在干冰或-70℃冰箱中，在该条件下，细胞可以稳定保存至少6个月。
4.2电转化
✓冰上解冻感受态细胞。
对将要电转的每个样品，预先准备一个1.5mlEP管和0.1或0.2cm电转杯冰上预冷。
✓在预冷的1.5mlPP管内，混合40μl细胞悬液和1-2μlDNA（DNA应该为低离子强度溶液，如TE）。
混匀，冰上孵育1min。
注意：
最好是在一个微量离心管中混合质粒和细胞，因电击杯的小槽不利于样品的均匀混合。
✓若选择0.1cm电击杯，请设置MicroPulser程序为“Ec1”，若选择0.2cm电击杯，则选择程序“Ec2”或“Ec3”。
具体仪器操作可见操作说明部分。
✓转移DNA和细胞的混合物至预冷的电击杯中，轻弹悬液使其落入电击杯底部。
将电击杯放入电击腔滑槽。
将滑槽推入电击腔，直至电击杯固定于电击腔的接触电极间。
电击一次。
✓从电击腔中移出电击杯，立即加入1mlSOC培养基。
用移液器迅速而轻柔地悬浮细胞。
电击后至将细胞转移至生长培养基的时间间隔对E.coli转化子恢复生长是非常关键的（Doweretal，1988）。
这一过程即使只延迟1min，都会导致转化效率3倍的降低。
延迟10min则降低20倍。
✓转移细胞悬液至17×100mmPP管，37℃、225rpm振荡培养1小时。
✓检查和记录脉冲参数。
时间常数应接近5ms。
电场强度可以通过实际电压（kV）/电击杯间隙宽度（cm）获得。
✓在筛选平板上涂平板。
4.3电转化所需溶液和试剂
✓LB：
10gBactotryptone，5gBactoyeastextract，5gNaCl；溶于1L水，高压灭菌。
✓10%（v/v）甘油：
12.6g甘油（密度为1.26g/cc）于90ml水。
高压或无菌过滤。
✓TE：
10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA。
✓SOC：
2%Bactotryptone，0.5%Bactoyeastextract，10mMNaCl，2.5mMKCl，10mMMgCl2，10mMMgSO4，20mM葡萄糖。
5、酿酒酵母（Saccharomycescerevisciae）的电转化
5.1感受态细胞的制备
参考Becker&Guarantee（1991）和Ausubeletal.（1987）的文献获取更多信息。
✓用2.8L三角培养瓶装500mlYPD培养基，向其中接种0.1-0.5ml（原文为analiquot一小份，未规定具体接种量）过夜菌液。
酿酒酵母在30℃条件下的的倍增时间大约为2小时。
✓30℃过夜培养，250rpm，至细胞密度为~1×108cells/ml（OD600=？
）。
✓于冰水浴中迅速冷却以停止生长。
✓将细胞倒入2个250ml离心瓶中，4℃、3000g离心5min。
✓小心倒掉上清液。
将有细胞沉淀的离心瓶置冰上。
✓向每个离心瓶中加入~50ml无菌、冰预冷的水，斡旋以重悬细胞沉淀。
调整瓶内液体的体积至250ml。
4℃、3000g离心5min。
倒去上清液。
✓用250ml无菌、冰预冷的水按上一步骤重复洗涤细胞一次。
✓用20ml无菌、冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞，转移细胞悬液至一个预冷的30mlOakridge管。
4℃、3000g离心5min。
小心倒去上清液。
✓用0.5ml无菌、冰预冷的1M山梨醇溶液重悬细胞沉淀。
最终的细胞体积约1.3ml，细胞浓度约1×1010cells/ml。
将细胞置于冰上并尽快使用。
5.2电转
✓吸取待转化的DNA样品（5-100ng/5μl）至一个1.5ml无菌EP管，置于冰上预冷。
✓如果使用0.2cm电击杯，向每个DNA样品加入40μl感受态细胞；如果使用0.4cm电击杯，则加入80μl感受态细胞。
轻柔混匀，冰上孵育~5min。
✓若使用0.2cm电击杯，则设置MicroPulser程序为“Sc2”；若使用0.4cm电击杯，则设置程序为“Sc4”。
✓转移DNA-细胞混合物样本至选定的且用冰预冷的电击杯中，轻弹电击杯使样本落于电击杯底部。
将电击杯放入电击腔滑槽。
将滑槽推入电击腔直至电击杯固定于电击腔的接触电极间。
电击一次。
✓从电击腔中移出电击杯，立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇。
轻柔转移细胞悬液至一个无菌管中。
✓检查和记录脉冲参数。
时间常数应接近5ms。
电场强度可以通过实际电压（kV）/电击杯间隙宽度（cm）获得。
✓在含有1M山梨醇的筛选平板上涂平板。
30℃培养48-72小时。
5.3电转化所需溶液和试剂
✓YPD：
10gyeastextract，20gpeptone，溶于900ml水，高压灭菌。
使用前加入100ml无菌葡萄糖。
✓1M山梨醇：
182.2g山梨醇，溶于800ml水，定容至1L。
高压灭菌。
✓20%葡萄糖：
20g葡萄糖，溶于60ml水。
定容至100ml。
0.22μm滤膜过滤除菌。
6、毕赤酵母（Pichiapastoris）的电转化
6.1感受态细胞的制备
参考Cregg&Russell（1998）的文献获取更多信息。
✓用2.8L三角培养瓶装500mlYP
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