三唑类杀菌剂对斑马鱼急性毒性研究.docx

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三唑类杀菌剂对斑马鱼急性毒性研究

三唑类杀菌剂对斑马鱼急性毒性研究

郭晶，宋文华丁峰，张金洋，李贞，陈小莹，张金花，连杰

【摘要】目的：

了解三唑类杀菌剂对环境中鱼类的急性毒性效应。

方式：

采纳静态实验法，参照OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment（OECD）203方式测定17种三唑类杀菌剂对斑马鱼96h急性毒性。

结果：

该类农药要紧为中等毒性和低毒污染物。

其中，烯效唑、己唑醇、丙环唑、戊菌唑、噁醚唑、腈菌唑和氟环唑对斑马鱼为中等毒性，其余化合物为低毒。

结论：

斑马鱼死亡率均随污染物浓度增加而增加，说明待测污染物与毒性之间存在剂量效应关系，而且取代基的不同可能造成结果类似化合物毒性不同较大。

本研究结果将有助于对三唑类杀菌剂水生生态风险评判，并为尔后利用定量构效关系研究三唑类杀菌剂对斑马鱼致毒机制提供基础。

【关键词】三唑类杀菌剂;斑马鱼;急性毒性

　　[Abstract]Objective：

Tofindouttheacutetoxicitiesofseventeentriazolefungicidestozebrafishat96h.Methods：

Theacutetoxicitiesofseventeentriazolefungicidestozebrafishat96hweredeterminedaccordingtostaticexperimentalmethodandOrganizationforEconomicCooperationandDevelopment（OECD）method203.Results:

Theresultsshowedthatthesetriazoleswereharmfulandtoxictozebrafish.Amongthesetriazoles,diniconazole,hexaconazole,propiconazole,penconazole,difenoconazole,myclobutanil,epoxiconazoleweretoxictozebrafish.Theotherswereharmfultozebrafish.Conclusion:

Themortalityrateincreaseswiththeincreasingconcentrationofpollutants.Doseeffectrelationshipareexistingbetweenpollutantsandtoxicities.Thisstudyisusedfortheevaluationoftheaquaticecologicalriskoftriazolefungicides,andlayafoundationtoresearchintothetoxicmechanismoftriazolefungicidestozebrafishbyusingquantitativestructureactivityrelationshipmethod.

　　[Keywords]triazolefungicide;zebrafish;acutelethaltoxicity

　　鱼类是国际上经常使用于测试化学品毒性的物种。

斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，作为环境毒理学的实验研究动物，斑马鱼因其价钱低廉、容易取得、治理饲养易行等诸多因素受到许多环保组织或国家的重视，他们已经将化学品对其急/慢性毒性作为评判污染物对水生环境危害程度的指标。

目前对斑马鱼环境毒理研究集中在有机污染物关于斑马鱼的初期发育阻碍[1]和胚胎发育学研究领域[2]，如S,is,man等[3]对多氯萘引发斑马鱼初期发育进程中的致畸效应进行了研究。

　　三唑类杀菌剂是70年代以来进展较快的一类高效农药，为目前世界公认的最有效、最有前途的杀菌剂，因其高效、广谱的杀菌成效和植物生长调剂活性[4-5]而广受关注。

三唑类杀菌剂对鱼类的胚胎具有毒性[6]，10-6mol·L-1以上的戊菌唑和烯唑醇均会对斑马鱼胚胎产生明显的致死、致畸、抑制发育等不良阻碍，而且呈现必然的时刻剂量依托性。

金洪钧等[7]测定了多效唑对草鱼的毒性，指出其长期慢性毒性和积存效应不容轻忽。

Ding等[8]研究了多效唑对斑马鱼酶活性的阻碍，发觉多效唑对斑马鱼肝脏中的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性均产生阻碍，表现出明显的“污染物兴奋效应”，但当化合物的浓度超过必然值后表现出抑制作用。

到目前为止，斑马鱼仍只被普遍用于胚胎发育学研究领域，关于三唑醇、腈菌唑、噁醚唑等三唑类杀菌剂关于斑马鱼的急性毒性系统的相关报导还较少。

本研究中测定了17种三唑类杀菌剂对斑马鱼96h急性毒性的大小，并表示为急性半数致死浓度（96h）[medianlethalconcentration，LC50（96h）]，本研究为成立三唑类杀菌剂对水生生态的阻碍奠定了基础。

　　1材料与方式

　　实验药品

　　17种待测化合物名称、纯度、生产厂家列于表1中。

二甲基亚砜（DMSO,.）和其他试剂均为分析纯，购自天津市北方天医化学试剂厂。

所有实验用水均参照OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment（OECD）的203方式，用超纯水配制的重组水。

　　将待测物加入重组水[8]及DMSO助溶剂（腈菌唑不需加助溶剂），经超声波混合均匀制得储蓄液。

再将储蓄液用再生水进行稀释，别离取得不同浓度的测试液。

最终，实验容器中DMSO的最终浓度低于%。

表1待测化合物名称、纯度、生产厂家编号名称CAS号生产厂家1三唑醇5521965395%粉剂，盐城利民农化2三唑酮4312143395%粉剂，江苏景宏化工3双苯三唑醇5517931295%粉剂，盐城利民农化4多效唑7673862095%粉剂，江苏景宏化工5烯效唑8365722195%粉剂，盐城利民农化6烯唑醇8365724390%粉剂，江苏景宏化工7

　　戊唑醇

　　107534963

　　250g·L-1乳油，江苏景宏化工8粉唑醇7667421095%粉剂，盐城利民农化9己唑醇7998371495%粉剂，盐城利民农化10环唑醇9436106%粉剂，江苏景宏化工11丙环唑6020790195%粉剂，盐城利民农化12戊菌唑6624688695%粉剂，苏州逸高化工13噁醚唑11944668395%粉剂，苏州逸高化工14腈菌唑8867189%乳油，沈阳化工研究所15氟环唑13385598895%粉剂，苏州逸高化工16氟硅唑8550919992%粉剂，盐城利民农化17三环唑4181478295%粉剂，盐城利民农化

　　实验动物

　　斑马鱼购于天津市宝鸡道花鸟鱼虫市场，体长±cm。

实验前需在实验条件下驯养3周，而且自然死亡率操纵在5%以下。

　　饲养条件

　　每日喂食康年虫两次，实验前24h停止喂食[9-10]。

水温维持在21～25℃，天天光照12h，充分曝气使得氧饱和度不低于80%。

　　要紧仪器

　　移液枪，ThermoLabsystems，上海雷勃分析仪器;电子分析天平，FA2004，天津天马仪器厂。

　　斑马鱼急性毒性实验方式

　　正式实验污染物浓度设计方式：

第一进行预实验，以确信正式实验浓度的大致范围。

依照预实验求得的斑马鱼全致死浓度和全不致死浓度，依照等对数间距原那么设定正式实验农药的浓度梯度（表2）。

　　急性毒性正式实验：

采纳静态实验法，将驯养好的斑马鱼放入含5L水的鱼缸，加入不同浓度的农药实验液，每种农药设置5个浓度梯度，同时设定水空白对照组和助溶剂（DMSO）对照组。

每一个处置均设置3个平行，每一个浓度组放置10尾鱼。

实验期间温度操纵在（23±1）℃，不中断曝气。

实验期间不喂食，持续观看斑马鱼中毒病症并及时捞出死亡个体，别离于24、4八、72和96h时记录斑马鱼死亡数。

表2待测农药斑马鱼急性运动抑制毒性实验浓度

　　Tab2VariousconcentrationsofD.rerioacutetesttotriazoles

　　编号测试浓度/mg·　　统计学分析

　　应用SPSS（SPSSInc.,Chicago,USA）软件中的Probit命令对死亡率进行统计学计算，计算取得三唑类杀菌剂对斑马鱼LC50（96h）值及其相应95%置信区间。

　　2结果与讨论

　　结果

　　依照不同浓度处置组暴露下斑马鱼死亡情形，计算取得污染物96h斑马鱼LC50值。

欧洲化学品治理局（EuropeanChemicalsBureau，ECB）[11]和OECD[12]均参照一样的标准，利用LC50（96h）值将污染物对水生生物的危害程度分为有害、有毒和剧毒3种类型（表3）。

表3ECB和OECD鱼类毒性级别分类标准

　　Tab3ClassificationstandardsofthetoxicitytofishconstitutedbyECBandOECDguidelines

　　毒性分级96hLC50/mg·L-13级：

有害10

　　不同三唑类杀菌剂对斑马鱼LC50（96h），95%置信区间和毒性分类见表4。

该类污染物对斑马鱼的毒性要紧为有害和有毒，其中烯效唑、己唑醇、丙环唑、戊菌唑、噁醚唑、腈菌唑和氟环唑对斑马鱼为有毒，Athanasopoulos等[13]的研究说明，斑马鱼对腈菌唑较为灵敏，这与实验结果一致。

Knauer等[14]研究说明，腈菌唑对鱼类的毒性约为多效唑的4倍。

在本研究中，腈菌唑对斑马鱼的毒性远大于多效唑，与Knauer等[14]的研究结果类似。

其余化合物为有害，其中烯效唑对鱼类虽为有害，可是接近有毒，其毒性作用仍不可轻忽。

由表4能够看出，17种三唑类杀菌剂对斑马鱼的毒性也存在较大不同。

其中，氟硅唑的毒性最大，LC50为mg·L-1，噁醚唑与氟硅唑毒性不同不显著，LC50为mg·L-1;粉唑醇对斑马鱼的毒性显著低于其它污染物（P<，其LC50为mg·L-1。

另外，丙环唑、烯唑醇、戊菌唑和己唑醇对斑马鱼的毒性不同不显著（P>，双苯三唑醇、戊唑醇、三环唑、烯效唑和氟环唑的毒性大小不同也不显著（P>。

表4三唑类杀菌剂对斑马鱼LC50（96h）和95%置信区间

　　讨论

　　斑马鱼对不同浓度的待测农药试液均表现出不同的中毒反映。

实验进程中，斑马鱼的中毒病症随浓度的提高而越发明显。

实验初期，低浓度处置组的斑马鱼在实验容器底部水层集群缓慢游动，无异样行为，与对照组大体相似;但是高浓度处置组斑马鱼放入实验容器后专门快表现出快速游动、急躁不安、集群现象消失等。

随着染毒时刻的延长，鱼游动速度慢慢变慢，活力慢慢减弱，开始显现沉底现象，对外界刺激反映也变得较为迟缓，最终死亡。

以往有研究发觉三唑类杀菌剂能够使哺乳动物表现出性能亢奋的现象[15-17]，与本实验结果存在相似性。

另外，随着农药浓度的增加，斑马鱼死亡率显现慢慢上升的趋势，说明各污染物与毒性之间存在剂量效应关系。

　　本课题组前期研究了一样的17种三唑类杀菌剂对大型溞48h急性运动抑制毒性[18]，通过比较该类农药对大型溞和斑马鱼的急性毒性效应能够看出，氟硅唑对二者的毒性均为最大，粉唑醇对二者的毒性均为最小，而且17种三唑类杀菌剂对大型溞和斑马鱼的毒性效应顺序类似。

与斑马鱼相较，三唑酮、双苯三唑醇、戊唑醇、腈菌唑、氟硅唑和三环唑对大型溞毒性均提高一级，毒性取得增强，其余化合物对大型溞和斑马鱼的急性毒性比较接近。

其中，腈菌唑对蚤类为剧毒，毒性较大，但是对斑马鱼却为有毒[LC50（96h）为mg·L-1]，远小于其对大型溞的急性毒性。

氟硅唑对蚤类属于剧毒[EC50（96h）为mg·L-1]，而且在17种污染物中毒性最大，一样其毒性远高于其对斑马鱼毒性[LC50（96h）为mg·L-1]。

　　17种三唑类杀菌剂中，显现了某些结构类似化合物对同种水生生物的毒性效应相差较大的情形。

如三唑酮（羰基）与三唑醇（羟基）具有类似的结构，毒性却存在显著不同（P<，三唑酮对大型溞毒性比三唑醇却高出一个级别，推测其缘故可能是由于氧原子取代基的不同致使化合物具有不同的毒性。

氟硅唑和粉唑醇具有类似结构，可是统计学分析说明，关于大型溞和斑马鱼而言，氟硅唑均为毒性最大（P<，而粉唑醇却具有最小毒性（P<,这可能是由于粉唑醇中羟基与碳原子相连，氟原子在苯环邻位取代，而氟硅唑此处为甲基与硅原子相连和氟原子在对位取代所造成的。

3DQSAR与HQSAR能够对污染物的致毒机制和活性位点进行更为详细、深切的研究，因此以上猜想还需进行进一步的3DQSAR或HQSAR研究来进行验证，确认可能的活性致毒位点。

　　3结论

　　该类三唑杀菌剂中存在对水生生物剧毒和有毒污染物，因此该类污染物对水体环境的污染应当引发人们足够的重视，须踊跃采取方法来排除因普遍利用而对水体环境造成的污染。

可将斑马鱼半数致死浓度作为水环境中该类农药污染程度的指示，以期为操纵水环境污染和农药的平安性利用提供科学依据。

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