实验16酶的特异性和影响酶反应速度的因素.docx
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实验16酶的特异性和影响酶反应速度的因素
实验16酶的特异性和影响酶反应速度的因素
一、目的
1、了解酶的特异性。
2、了解温度、pH值、激活剂和抑制剂等因素对酶反应速度的影响。
3、掌握检查酶的特异性,酶的激活剂和抑制剂影响酶反应速度的方法及原理。
4、学习测定酶最适pH值的方法。
二、原理
酶是生物体中具有催化功能的蛋白质,因此也叫生物催生剂。
生物体内存在多种多样的酶,从而使生物体在温和的条件下能迅速完成复杂的生物化学反应。
酶具高度的特异性。
所谓特异性是指一种酶能对一种化合物或一类化合物起催化作用,而不能对别的物质发生催化反应。
淀粉和蔗糖无还原性。
唾液淀粉酶水解溶粉生成有还原性的麦芽糖,但不能催化蔗糖水解。
蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性的葡萄糖和果糖,但不能催化淀粉水解,用Benedict试剂检查糖的还原性。
温度和pH对酶的活性有显著的影响,使反应速度达最大反应值时的温度称为某种酶作用的最适温度。
大多数动物酶的最适温度为37℃~40℃,植物酶的最适温度为50℃~60℃,能使酶表现其活性最高时的pH值称为该酶的最适pH值,不同酶的最适pH值不同。
酶的活性常受某些物质的影响,能使酶活性增加的物质称为酶的激活剂,能使酶的活性降低的物质称为酶的抑制剂。
氯离子为唾液淀粉酶的激活剂,铜离子为其抑制剂。
三、材料、试剂与器具
（一）材料
1、干酵母
2、黄豆粉
（二）试剂
1、2%蔗糖溶液:
蔗糖是典型的非还原糖,若商品蔗糖中还原糖含量超过一定标准,则呈现还原性,这种蔗糖不能使用,所以实验必须进行检查,本实验用的蔗糖至少应是分析纯的试剂。
2、0.3%氯化钠的1%淀粉溶液（新配制）。
3、释释200倍的新鲜唾液（5滴唾液,加蒸馏水稀释至50毫升）。
4、蔗糖酶溶液:
取干酵母100克,置于乳钵内,加适量的蒸馏水和少量石英砂,用力研磨提取1小时,再加蒸馏水使总体积约500毫升,过滤,将滤液保存于冰箱备用。
5、本尼迪克特试剂（Benedict）:
将硫酸铜17.3克溶于100毫升热蒸馏水中,冷却,稀释至150毫升,取柠檬酸钠173克及无水碳酸钠（Na2CO3）100克,加水600毫升,加热使之溶解,冷后后稀释至850毫升。
最后把硫酸铜溶液缓缓倒入柠檬酸钠一碳酸钠溶液中,摇匀,用细口瓶贮存,此试剂可以保存很久。
6、0.1%淀粉溶液。
7、1%氯化钠溶液。
8、1%硫酸铜溶液
9、1%的硫酸钠溶液
10、碘化钾—碘溶液（稀）。
11、0.3%氯化钠0.2%淀粉溶液。
12、1%尿素溶液
13、脲酶提取液:
取黄豆粉6克,加30%乙醇250毫升,振荡10分钟,过滤,可保存1~2星期。
14、奈斯勒试剂:
称取5克碘化钾,溶于5毫升蒸馏水中,加入饱和氯化汞溶液（100毫升约溶解5.7克氯化汞）并不断搅拌。
直至产生的朱红沉淀不再溶解时,再加40毫升50%氢氧化钠溶液,稀释100毫升,混匀,静置过夜,倾出清液于棕色瓶中。
15、0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液（新配制）
16、0.2M磷酸氢二钠溶液
17、0.1M柠檬酸溶液
（三）器具
1、试管及试管架
2、移液管（1,2,5毫升）
3、冰浴
4、恒温水浴
5、白瓷板
6、秒表
四、操作步骤
（一）酶的特异性
1、淀粉酶的特异性实验
取试管6支,编号,按下表进行操作
管号
1
2
3
4
5
6
1%淀粉溶液（滴）
4
4
4
2%蔗糖溶液（滴）
4
4
4
稀释唾液（ml）
1
1
煮沸过的稀释唾液（ml）
1
1
蒸馏水（ml）
1
1
37℃恒温水浴15分钟
Benedicty试剂（ml）
2
2
2
2
2
2
沸水浴2~3分钟
现象
解释结果
2、蔗糖酶的特异性实验
取试管6支,编号,按下表进行操作管号
1
3
4
5
6
1%淀粉溶液（滴）4
4
4
2%蔗糖溶液（滴）
4
4
4
蔗糖酶溶液（ml）
1
1
煮沸过的蔗糖酶溶液（ml）
1
1
蒸馏水（ml）
1
1
37℃恒温水浴15分钟Benedict试剂（ml）
2
2
2
2
2
2
沸水溶2-3分钟
现象
解释结果
（二）酶的激活剂及抑制剂
取试管4支,编号,按下表加入试剂管号
1
2
3
4
0.1%淀粉溶液（ml）
3
3
3
3
稀释唾液（ml）
1
1
1
1
1%硫酸铜溶液（ml）
1
1%氯化钠溶液（ml）
1
1%硫酸钠溶液（ml）
1
蒸馏水（ml）
1
37℃恒温水浴、保温10分钟碘化钾——碘溶液（滴）
2~3
2~3
2~3
2~3
现象
解释结果
说明本实验第3管的意义。
（三）温度对酶活性的影响
1、温度对唾液淀粉酶活性的影响
唾液淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小分子的糊精及麦芽糖。
它们遇碘各呈不同的颜色。
直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色,糊精按分子从大到小的顺序遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色,最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈颜色。
由于不同温度下唾液淀粉酶的活性高低不同,则淀粉被水解的程度不同。
所以,可由酶反应混合物遇碘所呈现颜色来判断。
取3支试管,编号后各加0.3%氯化钠的0.2%的淀粉溶液2毫升。
将第1、2号试管放入37℃恒温水浴中保温,第3号试管放入冰水中冷却,5分钟后,向第1号试管中加入煮沸5~15分钟的稀释唾液1毫升,向第2,3号试管加稀释唾液各1毫升。
摇匀。
20分钟后取出3支试管,各加入碘化钾—碘溶液2滴,混匀,比较各管溶液的颜色。
判断淀粉被唾液酶水解的程度,并说明温度对唾液酶活性的影响。
2、温度对脲酶活性的影响
脲酶能催化尿素水解生成氨和二氧化碳,氨可以与奈斯勒试剂作用生成红色化合物。
由颜色深浅可断定反应进行的程度。
NH2
NH2
脲酶
C=O+H2O——→2NH3+CO2
奈斯勒试剂碘化双贡铵（橙黄色）
取4支试管,编号,向每支试管中加入脲酶提取液1毫升。
将第1号试管放在冰水里冷却,第2号试管在室温上放置,第3号试管在50℃恒温水浴中保温,第4号试管在沸水中煮。
5分钟后分别向4支试管中加入1%尿素溶液1毫升,混匀,10分钟后取出4支试管,将第3,4号试管用流动的自来水冷却至室温。
然后向4支试管中加入奈斯勒试剂5滴,摇匀。
观察比较各试管颜色深浅,并说明温度对脲酶活性的影响。
（四）pH对酶活性的影响
（一）取4个50毫升锥形瓶,编号。
按下表中的比例,用吸量管添加0.2M磷酸氢二钠溶液0.1M柠檬酸溶液,制备pH5.0~8.0的4种缓冲液。
编号
0.2M磷酸氢二钠
Na2HPO4（毫升）
0.1M柠檬酸
C6H8O7H2O（毫升）
缓冲液pH
1
5.15
4.85
5.0
2
6.05
3.95
5.8
3
7.72
2.28
6.8
4
9.27
0.28
8.0
从4个锥形瓶中各取缓冲缓3毫升,分别放入4支带有号码的试管中,随后于每个试管中添加0.3%NaCl0.5%淀粉溶液2毫升和稀释200倍的唾液2毫升,向各试管中加入稀释唾液的时间间隔为1分钟。
将各试管中物质混匀,并依次置于37℃恒温水浴中保温。
待向第4管加入唾液2分钟后,每隔1分钟由第3管取出1滴混合液,置于白瓷板上,加1小滴碘化钾—碘溶液,检验淀粉的水解程度。
待混合液变为棕黄色时,向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液,加碘化钾—碘溶液的时间间隔,从第1管起,亦均为1分钟。
观察各试管中物质呈现的颜色,分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。
五、实验报告
以表格的形式总结酶的特异性及各种因素对酶促仅应的影响,并解释结果。
六、思考题
1、什么是酶的特异性?
本实验结果为什么能说明酶具有这种性质?
2、用煮沸后的蔗糖酶水解淀粉或蔗糖会产生什么现象?
这种试验与操一
（一）的作法有何区别,试说明酶学实验中安排对照实验的必要性。
3、激活剂与变性剂有何不同?
试举例说明。
4、抑制剂与变性剂有何不同?
试举说明。
5、为什可以用碘化钾—碘溶液作指示剂检查温度对唾液淀粉酶活性的影响?
6、酶在干燥的情况下与在水溶液中,它的活性受温度的影响是否相同?
这种性质对酶的保存有何意义?
7、酶反应的pH是否是一个常数?
它与哪些因素有关?
这性质对于选择测定酶活性的条件有什么意义?
8、通过几个酶实验,你对下面问题如何认识?
（1）酶作为生物催化剂具有哪些特性/
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